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尿足细胞B7-1分子的检测在原发性肾病综合征患者中的价值
目的：测定尿足细胞B7-1分子在原发性肾病综合征(PNS)患者中的表达水平，探讨它在PNS病情变化过程中的应用价值。方法：收集2014年1-7月笔者所在医院住院和门诊符合PNS诊断标准的患者共57例，PNS未治疗组有30例，治疗缓解组有27例，正常组有17例，采用酶联免疫试验(ELISA)测定尿足细胞B7-1分子的表达水平，分析尿足细胞B7-1分子与24 h尿蛋白定量、血肌酐和胱抑素C的关系。结果：未治疗组尿和缓解组B7-1分子水平均明显高于正常组，比较差异均有统计学意义(P<0.01)。未治疗组患者尿B7-1分子水平明显高于缓解组，两组比较差异有统计学意义(t=2.19，P<0.05)。相关性分析显示，未治疗组尿足细胞B7-1分子水平与24 h尿蛋白无相关性(r=-0.34，P>0.05)。PNS患者各组尿足细胞B7-1分子水平与血肌酐、胱抑素C均呈正相关(P<0.01)。结论：尿足细胞B7-1分子的测定可观察PNS患者疾病活动情况，对临床判断和评估肾脏损伤程度有一定的临床应用价值。
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血管内皮生长因子表达降低导致多柔比星肾病大鼠蛋白尿发生
目的 在经典多柔比星肾病大鼠模型中动态观察其蛋白尿发生前后血管内皮生长因子(VEGF)分布和表达的时相变化,及其与足细胞裂孔隔膜关键分子nephrin磷酸化水平之间的关系,以深入了解VEGF在蛋白尿发生机制中的作用.方法 1.留取正常大鼠(对照组)及多柔比星肾病大鼠模型(肾病组)3、7、14和28 d肾皮质标本.2.应用免疫组织化学染色法观察对照组及28 d肾病组大鼠肾组织VEGF分布.3.提取对照组及3、7、14和28 d肾病组大鼠肾皮质总RNA,应用反转录获得cDNA,实时定量RT-PCR检测其VEGFmRNA表达.4.提取对照组及3、7、14和28 d肾病组大鼠肾皮质总蛋白,应用免疫蛋白印迹检测其VEGF蛋白表达.5.提取对照组及28 d肾病组大鼠.肾皮质总蛋白,应用免疫沉淀分析其nephrin酪氨酸磷酸化水平.6.采用SPSS 10.0软件进行统计学分析,各时间点肾病组与对照组间比较采用t检验.结果 1.免疫组织化学染色显示对照组大鼠肾小球VEGF的染色较深,主要分布于肾小球足细胞及近端小管上皮细胞,系膜区亦有少许表达.在28 d肾病组大鼠,VEGF在肾小球足细胞和系膜区的染色明显减弱.2.与对照组比较,3、7、14及28 d各时间点肾病组大鼠肾皮质VEGF的mRNA表达无显著性改变(Pa＞0.05).3.与对照组比较,肾病组大鼠肾皮质VEGF蛋白表达于注射多柔比星后7 d显著降低(P＜0.05),且在14 d和28 d 2个时间点亦显著低于对照组(Pa＜0.01).4.与对照组比较,28 d肾病组大鼠肾皮质nephrin磷酸化水平显著降低(P＜0.05).结论 VEGF表达降低可能参与了多柔比星肾病大鼠蛋白尿的发生,VEGF与裂孔隔膜关键分子nephrin的磷酸化水平可能存在联系,它们相互协调、相互作用,共同参与维护肾小球滤过屏障结构和功能的完整.
关键词： 蛋白尿 足细胞分子 血管内皮生长因子 nephrin磷酸化 -
激素耐药肾病伴泌尿生殖器异常患儿的临床及WT1基因检测
目的:了解WT1基因突变在3例激素耐药肾病伴泌尿生殖器异常患儿的临床特点和致病作用.方法:采用间接免疫荧光及免疫组织化学的方法对2例患儿的肾组织行足细胞分子(nephrin,podocin,α-actinin4,WT1及CD2AP)表达;采用PCR及RT-PCR的方法检测WT1基因突变及+KTS/-KTS比例.结果:3例患儿发病年龄分别为6月、1岁及10岁,确诊年龄分别为7月、9岁及15岁.例1和例3为男性表型伴泌尿外生殖器异常,例2为女性表型;3例患儿染色体核型均为46,XY.临床均为激素耐药肾病,例1和例2肾脏病理为局灶节段性肾小球硬化(FSGS).对2例肾活检患儿肾组织标本的分析显示足细胞分子表达均发生改变;例1 WT1无表达,例2 WT1在足细胞核内的分布与正常对照不同.WT1基因分析示,WT1基因序列中例1未发现突变,例2为IVS 9+5 G＞A杂合突变,例3为WT1外显子91186 G＞A的杂合突变.结论:对于早发激素耐药肾病且病理为FSGS的女性患者或伴有泌尿生殖器异常的男性患者应行染色体核型和WT1基因分析.WT1突变引起足细胞分子表达发生改变,提示这些足细胞分子参与了蛋白尿的形成或发展.
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足细胞分子高表达致阿霉素肾病大鼠发生蛋白尿
目的动态观察足细胞裂孔隔膜复合体分子nephrin、podocin、CD2AP及α-actinin-4在阿霉素肾病大鼠蛋白尿发生发展中的表达变化,探讨其在蛋白尿发生发展中的分子行为及其机制.方法尾静脉注射阿霉素建立阿霉素肾病大鼠模型,3、7、14、28 d每组处死6只大鼠留取肾脏标本.应用间接免疫荧光染色、实时定量PCR、Western印迹分别检测各个时间点nephrin、podocin、CD2AP、α-actinin-4的分布、mRNA和蛋白表达量的变化.结果(1)14 d肾病组大鼠24 h尿蛋白显著高于对照组(P＜0.01),增高持续到28 d.(2)透射电镜显示14 d肾病组足突不同程度变宽,28 d足突弥漫性融合.(3)与对照组相比,从第7天开始肾病组nephrin和podocin染色从沿肾小球毛细血管袢线样分布向不连续粗颗粒样的分布模式转变;CD2AP节段染色增强区逐渐扩大,有的区域呈斑片状和连续线状增强;α-actinin-4从沿肾小球毛细血管袢均匀的点线样分布向不均匀粗颗粒的分布转变,而且随时间进展这种转变逐渐加重.(4)与对照组相比,肾病组于7 d时nephrin mRNA表达显著增高(P＜0.01);podocin mRNA表达14 d时显著增高(P＜0.05),直至28 d(P＜0.05);CD2AP mRNA表达28 d时显著增高(P＜0.05).(5)与对照组相比,肾病组nephrin蛋白表达28 d时显著增高(P＜0.05);podocin蛋白表达于7 d时显著增高(P＜0.05),而28 d时又显著降低(P＜0.05);CD2AP蛋白表达于14 d时显著增高(P＜0.05),直至28 d(P＜0.05).(6)α-actinin-4 mRNA与蛋白表达在实验过程中未出现明显变化.结论nephrin、podocin和CD2AP的表达增加及分布异常是导致阿霉素肾病大鼠蛋白尿发生发展的分子机制,而分子表达的增加是足细胞抵抗损伤的一种代偿反应.
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通过基因敲低探讨多个足细胞分子作用及分子间反应
目的研究足细胞裂孔隔膜(SD)复合体分子nephrin、podocin和CD2AP,以及足细胞骨架蛋白α-辅肌动蛋白(actinin)-4的作用及分子间反应.方法针对nephrin、podocin、CD2AP和α-actinin-4 mRNA序列分别设计并构建2个特异RNA干扰质粒-psiRNA-hH1GFPzeo,分别导入小鼠足细胞系MPC5以"敲低"其表达.免疫荧光染色观察其分布方式.半定量RT-PCR和免疫蛋白印迹检测其mRNA和蛋白表达.结果(1)podocin敲低组(siPod966和siPod54):未检测到podocin及nephrin mRNA,其蛋白分别下降了92%、79%及82%、67%.而CD2APmRNA和蛋白分别增加了62%、42%及71%、46%.α-actinin-4无变化.(2)nephrin敲低组(siNep492):未检测到nephrin mRNA和蛋白.而CD2AP mRNA和蛋白分别增加了35%、48%.podocin和α-actinin-4无变化.(3)CD2AP敲低组(siCda744和siCda21):未检测到CD2APmRNA,其蛋白分别下降了92%和83%.nephrin mRNA和蛋白分别下降了60%、48%及76%、72%;而podocin mRNA和蛋白分别增加了38%、22%及56%、44%.α-actinin-4无变化.(4)α-actinin-4敲低组(siAct1790和siAct319):α-actinin-4和nephrin的mRNA分别下降了69%、58%及64%、49%;蛋白分别下降了81%和55%以及71%、64%.而podocin以及CD2AP mRNA分别增加了50%、34%及45%、28%;蛋白分别增加了64%、46%及65%、42%.(5)敲低nephrin、podocin和CD2AP后,这些表达量降低的分子的分布发生了明显改变,即以核周为主;而相应分子敲低后引起的podocin和CD2AP表达增加,其分布亦主要以核周染色增强为主.α-actinin-4即使表达降低,分布亦无变化,仍呈细丝状分布于胞质及足细胞伸出的突起中.结论(1)在SD复合体分子中,nephrin可能具有相对独立的作用.(2)a-actinin-4对nephrin、podocin和CD2AP有直接或间接的作用.(3)足细胞分子间的作用和联系不总是"一致的",可能是"单向的"、也可能是"双向的".(4)nephrin、podocin、CD2AP和α-actinin-4在足细胞的分布有赖于其表达量的正常及正常的分子间反应.
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CD2相关蛋白在肾脏固有细胞中的表达及分布
CD2相关蛋白(CD2AP)是与蛋白尿发生密切相关的足细胞分子[1].近年研究表明,CD2AP不仅是足细胞足突间裂孔隔膜的重要成分,而且还参与细胞骨架的重构,可能参与细胞许多重要的生理功能[2,3].本研究通过观察CD2AP在肾脏固有细胞中的分布及其在足细胞分化中的分布变化,初步探讨其在足细胞中的生理功能.
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足细胞相关分子在非遗传性肾脏疾病肾组织中的表达
近年来,通过对先天性和(或)遗传性肾病综合征(NS)家系的研究,先后确定了一系列位于足细胞及裂孔隔膜(slit diaphragm,SD)上的蛋白分子.随后,研究者还从多方面研究足细胞分子在非遗传型(获得性,acquired)肾脏疾病蛋白尿发生发展中的作用及可能的机制,其中不乏大量有关足细胞分子在正常和各类肾脏疾病时肾组织的表达的探讨以及较丰富的研究结果.
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足细胞裂孔隔膜与信号传导
足细胞足突间的裂孔隔膜(slit diaphragm,SD)是肾小球滤过屏障重要的组成部分[1].直到近年,才通过对一些遗传性或先天性肾病综合征(NS)的研究先后确定了多个位于SD的蛋白分子,如nephrin、podocin、CD2AP、ZO-1、FAT和NEPH1等[2-7],并把这些分子组成的复杂结构称为"SD复合体"(SD complex)[8,9].随后,在一些获得性NS和肾病动物模型发现,这些足细胞分子的表达和分布也存在异常[10-13].可见,SD以"静态分子筛"(static molecular siever)的形式在肾脏的超滤中起着关键作用.
