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人牙周炎症组织中干(祖)细胞的分离培养及初步鉴定
目的:体外分离纯化人牙周炎症组织来源的干(祖)细胞,研究其生物学特性、表面标记物及多向分化能力.方法:用组织块消化法对人牙周炎症组织进行原代培养,经有限稀释法纯化细胞并连续培养,测定其生长曲线和克隆形成率,用免疫荧光化学染色检测细胞表面波形丝蛋白、STRO-1和CD146的表达,并对其进行成骨和成脂诱导,观察其分化能力.结果:从人牙周炎症组织中可提取出干(祖)细胞,该细胞具有较高克隆形成能力,波形丝蛋白、STRO-1、CD146表达阳性,具有成骨、成脂多向分化能力.结论:人牙周炎症组织中存在干(祖)细胞,为牙周组织工程种子细胞提供了新的可能来源.
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人牙周膜干细胞矿化诱导分化的实验研究
目的:体外分离纯化人牙周膜干细胞,研究其体外矿化能力,为牙周组织工程提供可靠的种子细胞来源. 方法:采用有限稀释法克隆分离纯化人牙周膜干细胞,将获得的第5代细胞用矿化液连续培养,观察矿化情况,进行矿化结节Von kossa染色;通过免疫组织化学染色技术检测诱导后细胞骨黏连素(ON)、骨桥蛋白(BSP)、Ⅰ型胶原(COLⅠ)、Ⅲ型胶原(COLⅢ)的表达. 结果:人牙周膜细胞在体外可以叠层生长,形成肉眼可见的灰白色结节,Von kossa染色显示结节内有钙盐沉积,该细胞诱导21 d后有矿化相关蛋白COLⅠ、COLⅢ,BSP、ON的阳性表达.结论:人牙周膜干细胞在体外矿化液作用下出现向成骨细胞的分化.
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人牙囊细胞的分离培养和生物学特性
目的:应用酶消化法体外培养人牙囊细胞并研究其生物学特性.方法:分离合法引产人胚胎乳牙胚的牙囊组织,消化法获得人牙囊细胞,HE染色观察细胞形态、免疫组织化学染色技术检测波形丝蛋白、Ⅰ型胶原表达,RT-PCR检测细胞的骨钙素、骨涎蛋白、碱性磷酸酶的表达.结果:原代培养的人牙囊细胞呈成纤维细胞形态,有部分上皮成分混杂,经纯化后可排除;在牙囊细胞中Ⅰ型胶原和波形丝蛋白的表达呈阳性,定位于细胞的胞质中;RT-PCR结果显示骨涎蛋白、骨钙素、碱性磷酸酶表达.结论:体外培养的人牙囊细胞具有成纤维细胞的特性,具有合成Ⅰ型胶原的能力;不同程度表达Ⅰ型胶原、骨钙素、骨涎蛋白、碱性磷酸酶等矿化相关蛋白.
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正常成年大鼠脑内环氧合酶-2的表达
目的:观察正常大鼠脑内环氧合酶-2(COX-2)的表达. 方法:用自行制备的COX-2多抗采用免疫组织化学ABC法观察了COX-2蛋白在正常成年大鼠脑内的表达. 结果:在正常成年大鼠脑内COX-2蛋白主要表达于皮层、海马、齿状回、视上核、杏仁核、小脑和脑干等部位,阳性细胞主要为神经元,神经胶质细胞染色很少. 结论:COX-2蛋白在脑内广泛分布.
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人源性成肌细胞和肌管细胞中β-Tubulin Ⅲ的表达
目的:确定来源于成年人骨骼肌的干细胞在离体条件下能否分化为神经细胞,为骨骼肌干细胞应用于移植治疗神经系统损伤和疾病打下基础. 方法:采用适用于大鼠的神经细胞诱导分化液诱导贴壁的人成肌细胞向神经细胞的分化;采用免疫细胞化学染色并结合Western Blot及RT-PCR等技术对不同培养液作用后的人成肌细胞进行β-Tubulin Ⅲ,Neurofilament Mr 68×103和GFAP表达的研究. 结果:用诱导分化液作用后,未见小的、伴有突起的放射状形态的神经细胞;抗β-Tubulin Ⅲ对经神经元-胶质细胞诱导分化液作用后的人成肌细胞、增殖培养液培养后的各代人成肌细胞及仅含20 mL/L HS分化液分化形成的肌管细胞染色均为阳性; C2C12细胞β-Tubulin Ⅲ抗体染色阴性;上述所有细胞抗Neurofilament Mr 68×103和抗GFAP染色均为阴性. RT-PCR和Western Blot验证上述β-Tubulin Ⅲ染色阳性的人成肌细胞和肌管细胞中β-Tubulin Ⅲ mRNA和蛋白质分子的表达. 结论:成年人骨骼肌干细胞不能被有效诱导分化成神经细胞;并证实人源性培养的成肌细胞和肌管细胞表达β-Tubulin Ⅲ,但是不表达Neurofilament Mr 68×103. 两种蛋白神经元标志物在人成肌细胞的表达不相吻合,我们对β-Tubulin Ⅲ能否作为人体组织横向分化研究的神经元特异的标志物提出疑问.
关键词： 人 肌肉干细胞 成肌细胞和肌管细胞 β-tubulin Ⅲ 免疫细胞化学 -
大鼠脑出血灶周围区粘附分子的表达
目的: 研究脑出血区粘附分子表达的动态变化,探讨脑出血的病理生理过程,为临床治疗脑出血提供理论依据. 方法: 纹状体内注入胶原酶造模,采用免疫组织化学ABC法观察粘附分子ICAM-1,VCAM-1和E-selectin在脑出血后24,72 h和7 d的表达变化. 结果: 大鼠脑出血后24,72 h和7 d组出血灶周围纹状体内均有明显的ICAM-1,VCAM-1和E-selectin免疫阳性细胞,与相同时间点的非出血侧纹状体比较均有显著差别(P<0.05);而且同一种粘附分子在不同时间点在出血灶周围的表达不全相同,24 h组出血侧3种粘附分子阳性的细胞数量多[ICAM-1,VCAM-1和E-selectin分别为(152±4),(141±2)和(131±4) mm2],72 h组[(44±3),(98±4)和(36±5) mm2]和7 d组[(43±3),(96±4)和(35±3) mm2]3种粘附分子阳性的细胞数量均减少,与24 h组比较有明显的统计学意义的差异(P<0.05),而72 h和7 d组之间无明显差异(P>0.05). 结论: 脑出血区粘附分子表达增高,可能存在与病程相关的炎性反应.
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大鼠脑出血灶周围区内胶质细胞纤维酸性蛋白的表达
目的: 研究脑出血区的胶质细胞反应. 方法: 大鼠纹状体内注入胶原酶造模,采用免疫组织化学ABC法观察出血区胶质细胞纤维酸性蛋白(GFAP)在出血后不同时间点的表达. 结果: 脑出血后出血灶周围区有明显的GFAP免疫反应阳性的细胞,且不同时间点阳性细胞的数量和形态不同. 脑出血后早期(3～5 h) GFAP的表达强,阳性细胞胞体肥大、突起增粗、增长,阳性细胞数量较多(3 h为410±4;5 h为408±9),排列密集;脑出血后14和24 h GFAP阳性细胞数量(14 h为401±5;24 h为402±4)与3和5 h之间比较, 无明显统计学意义的差别(P>0.05);72 h后,GFAP阳性的细胞数量较出血早期显著减少(358±12),与3, 5, 14和24 h组比较均有明显差别(P<0.05),至脑出血7 d后阳性细胞数量(389±5)比72 h增加(P<0.05),但数量少于3和5 h(P<0.05). 在所有观察时间点非出血侧相应脑区几乎无或仅有弱的GFAP免疫反应阳性. 结论: 脑出血后病变部位存在明显的呈现独特的时间模式的胶质细胞反应,提示星状胶质细胞在脑出血的病理变化过程中有重要作用.
关键词： 大鼠 脑出血 胶质细胞纤维酸性蛋白 免疫细胞化学 -
重症肌无力中枢损害脾脏改变及细胞凋亡相关蛋白表达
目的: 探讨在重症肌无力(MG)中枢损害模型中脾脏变化和细胞凋亡相关蛋白改变及其意义. 方法: 分别将自MG患者血中提取的IgG和健康人血中提取的IgG注入大鼠脑室系统,建立大鼠MG模型和健康对照组模型,一组大鼠不予任何处理作为空白对照组.脾常规HE染色,并用免疫细胞化学方法观察FasL和Bag-1在脾脏中的表达. 结果: 模型大鼠表现出类似实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)动物模型样症状. 在MG组脾脏淋巴细胞增生明显,淋巴小结及生发中心数目增多,Bag-1抗原阳性细胞弥漫分布于白、红髓区,FasL仅偶见或无. 在健康对照组脾脏中可散见Bag-1和FasL表达(P<0.05), 两种对照模型镜下改变相似. 结论: 脑室注射抗神经肌接头(NMJ)处的AchRab 能够同中枢神经系统的AchR结合,引起外周免疫的变化,脾淋巴细胞增生,Bag-1表达增加,Fas/FasL表达受抑制. 这些可能导致EAMG脾脏中激活免疫细胞的正常凋亡过程抑制,并参与MG病变进展.
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UV通过p38MAPK促进大鼠胶质瘤C6细胞凋亡
目的: 探讨p38MAPK在紫外线损伤刺激细胞中的特异性信号转导作用. 方法: 流式细胞仪检测紫外线照射30 min后1,2及4 h的C6细胞周期变化和是否有凋亡发生;应用免疫细胞化学技术观察紫外线刺激前后p38MAPK在C6细胞中的表达强度和分布特征. 结果: 细胞周期结果显示1, 2和4 h后G1期细胞数分数各增多0.12, 0.21和0.19,而S期细胞数分数减少0.10,0.14和0.15;各组的凋亡率分别是12%,49%和34%;未受刺激的细胞中,p38MAPK在胞质和胞核表达较弱;紫外线损伤作用2 h后,细胞核区的染色强度即明显增强,而胞质区域的染色强度相对降低. 结论: C6细胞受紫外线损伤后可通过p38MAPK通路发生凋亡.
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体外顺铂诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡时细胞信号转导因子活性变化
目的体外使用顺铂诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡,检测细胞转导因子MAPKs及转录因子(JUN,CREB)活性的变化. 方法采用免疫细胞化学法和流式细胞术法. 结果 15 mg*L-1顺铂作用肝癌SMMC-7721培养细胞48 h可观察到明显的凋亡峰,72 h免疫细胞化学染色发现胞质或(和)胞核中MAPKs(JIN/SAPKs,p38MAPK,ERK)及转录因子(JUN, CREB)均有明显表达. 结论在体外顺铂诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡过程中,MAPKs途径(JIN/SAPKs,p38MAPK,ERK)及转录因子(JUN,CREB)参与诱导了细胞凋亡.
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被动免疫重症肌无力模型中枢神经系统损害的探讨
目的探讨乙酰胆碱受体抗体(AchRab)与重症肌无力(MG)中枢神经系统(CNS)损害之间关系. 方法将MG患者血中提取的IgG注入大鼠尾静脉,建立大鼠被动免疫重症肌无力模型,应用免疫细胞化学技术观察Fas在脑组织中的表达. 结果模型大鼠表现出类MG症状,在MG大鼠脑内Fas抗原主要表达于大脑皮质区和海马的神经元胞膜和突起上,而在正常和空白对照组脑内没有神经细胞呈Fas抗原阳性. 结论外周注入的AchRab可能造成模型处于免疫应激状态,改变血脑屏障通透性而入脑诱发CNS损害. Fas介导的细胞凋亡可能参与MG CNS 损害.
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大鼠神经系统内5-HT5A受体亚型的定位分布
目的观察大鼠神经系统内5-HT5A受体亚型(5-HT5AR)的定位分布. 方法 5-HT5AR特异性抗体的免疫细胞化学染色技术. 结果 5-HT5AR阳性神经元主要分布于斜角带核、终纹床核、视上核、室旁核、下丘脑前区、下丘脑腹内侧核、下丘脑外侧区、弓状核、视交叉上核、乳头体上核、杏仁基外侧核、蓝斑、面神经核、舌下神经核、中缝隐核、中缝苍白核、孤束核以及三叉神经节和脊神经节. 结论 5-HT5AR阳性结构比较广泛地分布于大鼠神经系统,5-HT可能通过5-HT5AR实现对神经系统多种功能活动的调控.
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转染野生型MTS1基因的膀胱癌细胞中p16蛋白的可控表达及意义
目的研究p16蛋白的可控表达. 方法通过可诱导的真核表达载体pMDNA3-p16将野生型多肿瘤抑制基因(multiple tumor suppressor1, MTS1)转染至该基因表达功能丧失的人膀胱癌细胞T24中. 应用免疫细胞化学和mRNA原位杂交的方法检测p16蛋白的表达. 结果经重金属离子诱导前与诱导后,T24细胞中p16蛋白的表达有明显差异. 结论通过重金属离子的诱导,可以调控T24细胞中p16蛋白的表达.
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人c-myc反义真核表达载体的构建及其对BT325细胞c-Myc蛋白表达的抑制作用
目的: 构建人c-myc第三外显子及3非翻译区反义真核表达载体,用脂质体介导法转染入胶质瘤BT325细胞,以期降低其c-Myc表达水平. 方法: 采用基因重组方法构建真核表达载体;用G418筛选抗性细胞克隆;用免疫细胞化学ABC法检测细胞蛋白质的表达;用MTT法测定顺铂作用下,未转染及转染组细胞的存活率. 结果: c-myc反义真核表达载体在BT325细胞中稳定表达,转染细胞c-Myc表达水平显著降低;c-Myc表达减弱细胞对顺铂诱导凋亡的敏感性. 结论: 抑制c-myc DNA第三外显子及其3端非翻译区反义表达载体能够显著抑制c-myc基因的表达;c-Myc在化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡的过程中有重要作用.
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人胎垂体生长素细胞的免疫细胞化学观察
目的: 探讨人胎垂体细胞的发生,为临床垂体移植挑选适宜胎龄提供依据. 方法: 用免疫细胞化学ABC方法,结合图像分析系统,系统观察4～8 mo人胎垂体生长素细胞的发育. 结果: 胎龄4 mo人胎垂体生长素免疫反应阳性细胞在垂体前叶周边已经出现,随胎龄增长,逐渐向垂体前叶的中央延伸,多排列成团或索状,细胞数量随着胎龄的增长逐渐增多;细胞密度胚胎早期升高,以后随胎龄增长逐渐下降. 细胞形态在胎龄4 mo时,胞体较小,呈圆形、卵圆形,胞核较大,胞质较少,以后随胎龄增长,胞体逐渐增大,胞质增多,核质之比逐渐变小,胚胎晚期细胞以大型、圆形为主. 结论: 人胎垂体移植以胎龄4 mo垂体作移植供体较为适宜.
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免疫细胞化学和形态学定量分析鉴别胸腹水良恶细胞的意义
目的:探讨免疫细胞化学和形态学分析在胸腹水细胞学鉴别诊断中的意义. 方法: 良恶性胸腹水各30例,应用免疫细胞化学SP法检测癌胚抗原(CEA)、上皮膜抗原(EMA)、波形蛋白(vimentin)的表达,并应用计算机图像分析系统定量测定其脱落细胞的核面积、浆面积、核浆比、细胞周长、平均直径、圆度和形状因子. 结果: 恶性胸腹水中腺癌细胞(B组)CEA表达均阳性,EMA部分阳性,vimentin均阴性;增生性间皮细胞(A组)EMA和vimentin部分阳性,CEA均阴性. 腺癌细胞的核面积、浆面积、核浆比、细胞周长、平均直径和形状因子高于增生性间皮细胞(P＜0.05), 两组间细胞圆度无统计学差异(P＞0.05). 结论: 免疫细胞化学在良恶性胸腹水鉴别诊断中有重要作用, 形态学定量分析可提供参考, 二者综合分析是提高胸腹水细胞学阳性诊断率的有效途径之一.
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胎儿软骨细胞体外培养过程中生长及代谢的变化
目的 探讨体外培养的软骨细胞形态及Ⅰ、Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达变化,为组织工程软骨种子细胞选择合适的回植时机.方法 取体外培养的第1-5代胎儿软骨细胞,观察细胞形态和细胞增殖率;用爱茜蓝(alcian blue)法检测软骨细胞聚集蛋白聚糖中糖胺聚糖含量;分别用免疫细胞化学和逆转录聚合酶链反应检测Ⅰ、Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖在蛋白和mRNA水平的表达.结果 体外培养的胎儿软骨细胞从第3代起逐渐向成纤维样细胞转换;各代软骨细胞糖胺聚糖的含量随传代次数的增加而逐渐降低,第3代后处于较低水平;第2代以前Ⅱ型胶原表达较强,Ⅰ型胶原表达较弱,之后随传代Ⅱ型胶原表达减弱,Ⅰ型胶原表达逐渐增强;而聚集蛋白聚糖在第3代以前表达较高,从第4代后明显下降.结论 人胎儿软骨细胞体外培养过程中,第2代软骨细胞从形态和功能上接近体内状况,可作为软骨组织工程的种子细胞.
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GAP-43在发育大鼠中枢神经系统的表达
目的研究神经生长相关蛋白质(GAP-43)在发育大鼠中枢神经系统的表达及其意义.方法选取生后5、15、30d正常雄性新生鼠,应用免疫细胞化学ABC法结合图像分析对其大脑皮质、海马及小脑皮质GAP-43表达进行研究.结果生后5d,GAP-43主要分布在神经元;生后15、30d,则分布在神经纤维网中,神经元胞体(包括锥体细胞、颗粒细胞和浦肯野细胞等)不染色;图像分析显示不同日龄新生鼠不同脑区GAP-43灰度值无显著性差异.结论 GAP-43是轴突生长、延伸的重要因子.
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大鼠脉络丛上皮细胞的原代培养与鉴定
目的 建立一种简便、实用的大鼠脉络丛上皮细胞的原代培养方法,以便进一步对其进行体外实验研究.方法 无菌条件下取1～9d的Sprague-Dawley大鼠脉络丛组织,经机械分离后将细胞种植于含100mL/L胎牛血清的DMEM培养基中进行培养,定期进行形态学观察并摄片.在培养第9天左右,采用电子显微镜及Hematoxylin&Eosin(HE)染色进行形态学观察,免疫细胞化学染色法鉴定并计算脉络丛上皮细胞的纯度.结果 培养的脉络丛上皮细胞呈梭形或多角形,电子显微镜下有微绒毛,细胞纯度在95％以上.结论 利用机械分散法分离新生大鼠脉络丛上皮细胞,进行原代培养可获得高纯度的脉络丛上皮细胞,该方法简便实用.
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大鼠颌下腺细胞中降钙素的定位及含量测定
目的 探讨大鼠颌下腺细胞中是否表达降钙素(CT),为进一步证明颌下腺与甲状腺C细胞具有同源性提供依据.方法 采用细胞培养、免疫细胞化学SP法以及原位杂交法进行降钙素的细胞定位及基因定位,并用酶联免疫法(ELISA)测定培养液中降钙素的含量.结果 大鼠颌下腺上皮细胞呈CT免疫反应阳性,阳性物质分布于胞质,胞核呈阴性反应.上述细胞同样含有CTmRNA杂交信号,信号物质亦分布于胞质内,胞核呈阴性反应.ELISA法测定大鼠颌下腺细胞培养液中降钙素的含量明显高于对照组.结论 大鼠颌下腺上皮细胞能分泌CT,提示大鼠颌下腺上皮细胞可能与甲状腺C细胞具有同源性.
