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PDGFR-β基因敲除小鼠上丘内Otx2和PV免疫反应阳性神经元的分布
目的:探讨血小板源性生长因子受体β (platelet-derived growth factor receptor-β,PDGFR-β)在上丘神经元的作用.方法:采用免疫细胞化学法和图像分析技术观察正常成年小鼠和PDGFR-β基因敲除小鼠上丘内Otx2和小白蛋白(parvalbumin,PV)免疫反应阳性神经元的形态、数目、大小及分布.结果:PDGFR-β基因敲除小鼠上丘内Otx2和PV免疫反应阳性神经元的基本形态及分布特征与正常小鼠无明显差别,即Otx2免疫反应阳性神经元密集地分布于上丘的浅层,而PV免疫反应阳性神经元则分布于上丘的各层.但这两种神经元的数目在PDGFR-β基因敲除小鼠却明显减少,其平均直径也较正常小鼠者明显为小.结论:PDGFR-β可能通过Otx2和PV等神经化学物质,参与上丘的功能形成与发育.
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NMDA受体在β-淀粉样蛋白引起海马神经元突触蛋白改变中的作用
为了研究NMDA受体活性对Aβ引发的海马神经元突触蛋白表达变化的影响,本文运用免疫细胞化学方法检测不同浓度NMDA受体激动剂以及拮抗剂对Aβ诱导的海马神经元突触蛋白变化的影响.结果显示:NMDA可浓度依赖性地缓解Aβ25-35引起的突触蛋白synaptophysin与PSD-95的减少.抑制突触内NMDA受体,NMDA缓解Aβ减少突触蛋白的作用减弱;抑制突触外NMDA受体,对抗Aβ的作用无显著变化.本研究结果提示NMDA受体活性改变影响Aβ诱导的突触蛋白减少,突触内NMDA受体激活可对抗AB的毒性作用.突触内NMDA受体活性减弱可能在谷氨酸兴奋毒性中发挥作用.
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胎儿海马内自分泌运动因子及其受体免疫反应阳性细胞的观察
为了观察自分泌运动因子及其受体在胎儿海马内的表达及分布特点,本研究应用免疫细胞化学技术显示胎儿海马内自分泌运动因子及其受体免疫反应阳性细胞.结果显示:17周时胎儿海马锥体细胞层内有自分泌运动因子及其受体的表达.随着胎龄的增长免疫反应阳性强度逐渐增强.提示自分泌运动因子及其受体可能参与海马锥体细胞层内细胞的迁移、发育等过程.
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己烯雌酚对体外培养中脑神经元的保护作用
为观察己烯雌酚对体外培养的胎鼠中脑神经元的影响,将孕14 d的SD胎鼠中脑取出,制成细胞悬液后种植在24孔培养板中.实验分空白对照组和己烯雌酚组(浓度分别为10-9、10-8、10-7 mol/L).用倒置显微镜观察各组细胞的存活及生长状况,并用免疫细胞化学方法测定各组细胞神经元特异烯醇化酶(NSE)及c-Fos蛋白阳性表达情况.结果显示,己烯雌酚浓度在10-8mol/L时细胞容易贴壁,突起形成早而多,NSE、c-Fos阳性细胞数与对照组及低浓度组有显著差异(P＜0.05),与高浓度组无显著差异.由此提示己烯雌酚对中脑神经元具有保护作用,并能提高其功能活性.
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人胚胎脑海马区神经前体细胞移植到损伤的成年大鼠脑内存活及迁移的研究
本文从人胚胎脑海马区分离、培养、鉴定了神经前体细胞(neural precursor cells,NPCs),并初步观察了大鼠纹状体海人酸(kainic acid,KA)损伤后,人神经前体细胞(hNPCs)移植到成年大鼠侧脑室和纹状体后存活和迁移的情况.取胎龄8～12周的人胚胎脑海马区细胞,用含人表皮生长因子(human epidermal growthfactor,h-EGF)、人碱性成纤维细胞生长因子(human basic fibroblast growthfactor,h-bFGF)以及人白细胞抑制因子(humanleukemiainhibitory growthfactor,h-LIF)的DMEM/F12培养液离体培养,以含1%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM/F12诱导分化,巢蛋白(nestin)免疫荧光染色鉴定NPCs的特征.向成年大鼠右侧纹状体内立体定位注射KA,造成大鼠纹状体局部损伤.用溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)体外标记第2代hNPCs,48 h后分别移植到正常成年大鼠和损伤大鼠手术侧的侧脑室和纹状体.6周后用抗BrdU抗体检测HNPCs的存活和迁移.结果显示:体外培养呈悬浮球状生长的细胞是nestin阳性的hNPCs.hNPCs移植6周后,在大鼠损伤侧的纹状体和侧脑室内,均检测到了BrdU阳性细胞,并有一部分细胞迁移到了周围纹状体实质和胼胝体.结果提示:体外分离培养的hNPCs移植到成年大鼠脑损伤区周围可以存活和迁移,损伤区域可能对移植细胞的迁移有一定的诱向作用.
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蝎毒耐热蛋白对原代培养海马神经元NPY表达的影响
探讨具有抗癫痫反复发作作用的蝎毒耐热蛋白(scorpion venom heat-resistant protein,SVHRP)对大鼠海马神经元神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)表达的影响.采用免疫细胞化学ABC法与HPIAS系列彩色病理图文定量分析系统相结合,检测NPY-免疫阳性产物(NPY-IR)表达的变化,用RT-PCR技术观察NPY mRNA表达水平的变化.终浓度范围为0.2、2、20和200μg/ml的SVHRP分别与培养10 d的海马神经元共孵育24 h后,NPY阳性神经元的反应强度明显增强,具有剂量-反应关系.终浓度为20μg/ml的SVHRP分别与培养10 d的海马神经元共孵育3、6、9、12和24 h,NPY阳性反应强度增强,并呈时间-反应关系.RT-PCR结果显示,20μg/ml的SVHRP与原代培养海马神经元共孵育24 h后,NPY mRNA的表达明显增加.以上结果提示SVHRP可诱导原代培养海马神经元NPY阳性反应和NPY mRNA的表达.
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单侧坐骨神经完全结扎对大鼠腰段背根神经节内VGluT1阳性神经元的影响
本实验将大鼠分为两组(正常对照组和单侧坐骨神经完全结扎组),采用免疫细胞化学和中性红复染的方法分别观察了正常大鼠和单侧坐骨神经完全结扎后存活不同时间组大鼠腰4(L4)节段的背根神经节(DRG)内Ⅰ型囊泡膜谷氨酸转运体(VGluT1)样阳性神经元的分布及其数量的变化.结果如下:(1)正常大鼠L4节段的DRG内可观察到VGluT1样阳性产物呈点状或斑状分布于胞浆内,有大约71.5%的DRG细胞表达VGluT1样免疫阳性,其中以大型(＞40 μm)和中等大小(20～40 μm)的神经元为主(分别占整个VGluT1样阳性细胞总数的30.7%和65.9%);(2)坐骨神经结扎后第1、2 d,在结扎同侧L4节段的DRG内未检测到VGluT1样阳性神经元数量的明显变化;但自术后第4 d开始,VGluT1样阳性神经元的数量随术后存活时间的延长逐渐减少.结扎1～4周大鼠DRG内VGluT1样阳性神经元数量在同一个动物的手术侧与对照侧相比有明显减少(P＜0.01);而结扎1～4周大鼠的手术侧DRG内VGluT1样阳性神经元的数量也明显低于结扎1～3 d大鼠的手术侧(P＜0.05或P＜0.01).以上结果表明,DRG内合成VGluT1样阳性物质的神经元主要是大、中型细胞,DRG细胞可通过轴浆流将VGLluT1向周围突运输,故外周神经的损伤很易影响到DRG神经元内VGluT1的合成.
关键词： Ⅰ型囊泡膜谷氨酸转运体 免疫细胞化学 背根神经节 坐骨神经 大鼠 -
内源性GDNF、NT-4对针刺猫脊髓备用根背根节神经元的作用
为了解部分背根切除和针刺及内源性GDNF和NT-4对体外培养备用背根节(DRG)的作用,本研究对5只成年猫进行双侧备用根手术(切除双侧L1～L5和L7～S2 DRG,其中L6 DRG作为备用背根).术后当日开始针刺一侧L6脊神经后肢分布区的两组穴位,即足三里和悬钟、伏兔和三阴交,每天一次,每次30 min,连续针刺7d后无菌条件下取出双侧L6 DRG进行体外培养,24 h后全量换液,并将针刺侧的一部分培养孔的培养液分别用含有200 ng/ml抗GDNF和NT-4抗体培养液替换,分别作为抗GDNF和NT-4抗体封闭组.7 d后终止培养,于显微镜下用显微测微尺测量神经突起的长度;并用抗NSE抗体行免疫细胞化学ABC法染色进行神经元鉴定.结果显示:(1)免疫细胞化学染色可见体外培养的细胞95%以上为NSE阳性细胞,且为典型的体外培养的DRG神经元;(2)体外培养备用根组和抗GDNF抗体组神经突起的平均长度比针刺组的短(P＜0.05);(3)而针刺组神经突起的平均长度与抗NT-4抗体组间无差异(P＞0.05);两抗体组平均突起长度比备用根组的突起长(P＜0.05).本研究结果提示,针刺可促进体外培养DRG神经元突起的生长,进而可能与脊髓可塑性密切相关;内源性GDNF有促进DRG神经元突起生长的作用;而内源性NT-4在DRG神经元突起生长中发挥的作用却不明显.
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新生大鼠海马源性神经干细胞的分离培养及其向胆碱能神经元定向诱导分化研究
本研究目的是从新生SD大鼠海马分离、培养神经干细胞并诱导其向胆碱能神经元方向分化.利用含b-FGF(20 ng/ml)和B27的无血清DMEM/F12培养基培养新生SD大鼠海马分离的具有自我更新和多向分化能力的细胞群,用免疫细胞化学技术检测巢蛋白(nestin),并于分化后分别检查特异性成熟神经细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞的标记抗原β-微管蛋白(Tuj1)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和半乳糖脑苷脂(Galc)的表达;用鸡胚骨骼肌提取液,诱导神经干细胞向胆碱能神经元方向分化.结果显示:从海马分离的细胞群具有自我更新能力,表达nestin,分化成熟后的细胞表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原;与对照组3.9%相比,鸡胚骨骼肌提取液可以诱导这些细胞中的9.6%分化成为胆碱能神经元.提示分离的细胞具有自我更新能力和多向分化潜能,是中枢神经系统的干细胞;在加有鸡胚骨骼肌提取液的培养基诱导下,能向胆碱能神经元方向分化.
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雌性大鼠下丘脑5-羟色胺1A和2A受体亚型的定位分布
本研究应用免疫细胞化学技术观察了雌性成年SD大鼠下丘脑内5-HT1A受体亚型(5-HT1AR)和5-HT2AR免疫阳性结构的分布.结果显示:5-HT 1AR免疫阳性神经元在视前区大细胞核、视前室周核、视上核和下丘脑外侧前核等核团内密集分布.在内侧视前核、外侧视前区、下丘脑室周核、下丘脑外侧区、背内侧核、腹内侧核、结节核、结节乳头体核、乳头体内侧核和乳头体外侧核等结构内也有较多的分布;而在正中视前核、视交叉上核、下丘脑室旁核、下丘脑背侧核、弓状核、乳头体上核和乳头体前核等部位有散在的分布.与5-HT1AR不同,5-HT2AR免疫阳性反应产物主要见于纤维和终末,阳性胞体少且染色淡.5-HT2AR阳性胞体见于下丘脑室旁核、视上核、腹内侧核、结节核、视前内侧区、外侧区、外侧前核、下丘脑背内侧核等处.另外,在视前区前内侧视前核、视交叉上核背侧和外侧可见围绕血管分布、密集成团簇状、带有大小不同膨体的阳性神经纤维缠结.本文结果提示5-HT1AR阳性结构广泛地分布于大鼠下丘脑,而5-HT2AR在下丘脑分布较为局限.二者不同的分布特点,提示它们可能介导5-HT在下丘脑的不同生理功能.
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胎鼠大脑皮质神经元的体外培养及鉴定
为了建立SD大鼠大脑皮质神经元的分离、培养及免疫细胞化学鉴定技术,本研究通过分离孕1 5 d SD胎鼠大脑皮质组织,经机械吹打后,加入含有5%马血清、5%小牛血清的MEM培养基接种在24孔培养板中进行原代培养,并于第3 d在培养基中加入阿糖胞苷抑制胶质细胞的生长,于第9 d将细胞固定后采用免疫细胞化学技术检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达.结果表明从孕15 d SD胎鼠大脑皮质分离的神经元纯度高,生长旺盛,形态典型,90%以上表达NSE免疫阳性.该结果提示我们建立的培养大鼠大脑皮质神经元的方法易于标准化操作,结果稳定,值得推广应用.
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成年大鼠活体嗅粘膜原代培养细胞中神经干细胞的生长特性及形态学观察
为建立成年活体嗅粘膜神经干细胞的简便、实用的体外培养方法,进而为神经干细胞自体移植治疗中枢神经系统损伤的研究提供更为安全的候选细胞,本实验自成年大鼠活体分离剪取部分嗅粘膜经胰酶消化制成细胞悬液,接种于玻璃培养皿,用含10%胎牛血清的F12培养基培养,动态观察神经干细胞克隆球的形成及分化过程,并用nestin、NSE、GFAP、vimentin及laminin等抗体作免疫细胞化学染色,对阳性细胞进行形态学鉴定.结果显示,成年大鼠经嗅粘膜活体取材后,可长期存活.成体嗅粘膜细胞混合体外培养时不同类型细胞的贴壁时间存在差异,神经干细胞呈球形,不直接贴附于培养皿,仅粘着在首先贴壁的扁平基底细胞上分裂形成克隆球,球内细胞nestin免疫细胞化学染色阳性.原代培养14 d后克隆球不再生长,球周细胞逐渐向外迁移分化为嗅细胞和嗅鞘细胞.提示,成体嗅粘膜神经干细胞可在普通培养基中形成干细胞克隆球,嗅粘膜中的其它细胞作为神经干细胞的基底饲养细胞有助于干细胞克隆球的形成;活体分离成体嗅粘膜作混合细胞体外培养获取神经干细胞的方法简便、安全、可行;本结果为嗅粘膜神经干细胞自体移植治疗中枢神经系统损伤的可行性研究提供了动物实验资料.
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巢蛋白在体外培养的大鼠骨骼肌卫星细胞发育过程中的表达--免疫细胞化学研究
为了观察巢蛋白(nestin)在骨骼肌卫星细胞发育过程中的分布状况以进一步探讨nestin在肌细胞发育中的作用,本实验对新生Wistar大鼠股部骨骼肌传代培养后,在不同发育期进行nestin单克隆抗体的ABC免疫组织化学反应,并以抗actin,desmin单克隆抗体作同期对照;计算阳性肌卫星细胞数量并进行统计学分析.结果发现:actin,desmin,nestin三组间在同一培养时间点上的阳性肌卫星细胞数量无差异(P＞0.05),但在时间点之间的比较上,4 h组较2 h组的阳性肌卫星细胞数量有所增加(P＜0.05),其余各时间组的阳性肌卫星细胞数量则显著高于2 h组、4 h组(P＜0.01).提示:nestin在体外培养的骨骼肌卫星细胞发育过程中有表达.
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体外培养海马神经元NR1型受体表达的发育性变化
用免疫细胞化学方法检测了体外培养的大鼠海马神经元不同培养时期的N-甲基-D-天门冬氨酸受体1型亚单位的免疫活性反应强度,并用图象分析方法进行了定量研究.结果显示:体外培养的海马神经元的N-甲基-D-天门冬氨酸受体1型亚单位的免疫反应强度,在培养第1 d时较弱,第2 d、第4 d和第7 d时反应强度逐渐加强,分别为1 d的2.44、3.82和4.18倍,随后反应强度稍有下降,第10 d、第14 d分别为第1 d的3.71和3.65倍.表明:体外培养的海马神经元在发育进程中N-甲基-D-天门冬氨酸受体1型亚单位表达进行性增加;当神经元发育成熟时,则其表达不再增加.提示:N-甲基-D-天门冬氨酸受体1型亚单位与神经功能成熟有关.
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成人海马内Nestin免疫阳性细胞的分布
为探讨成人海马内Nestin免疫阳性细胞的分布,本实验采用331B、10C2、Rat401、NSE、GFAP、Vimentin抗体对成人海马了进行免疫组织化学研究.结果显示,海马内Nestin免疫阳性细胞可分为三类:一类细胞位于门区及齿状回颗粒下层,胞体为卵圆形,无突起,胞浆深染,此类细胞不与NSE呈交叉反应;第二类细胞也位于门区及齿状回颗粒下层,胞体较小发出少量放射状突起,与GFAP及Vimentin抗体无交叉反应,在海马裂及海马伞中也存在少量的此类神经细胞;第三类为Nestin免疫阳性细胞,体积较大,形态与星形胶质细胞相似,并分别位于齿状回分子层及颗粒层,其突起常常跨越齿状回颗粒细胞层.Nestin免疫阳性神经细胞不被GFAP抗体标记.成人海马内未见Vimentin免疫阳性细胞.结论:人海马内存在神经前体细胞及放射状胶质样Nestin免疫阳性细胞.
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P物质阳性神经纤维对球海绵体肌和坐骨海绵体肌运动神经元的支配一HRP逆行示踪与免疫细胞化学研究
本研究应用HRP逆行示踪与免疫细胞化学相结合的双重反应技术观察了P物质纤维与前角躯体运动神经元的关系.用WGA-HRP经大鼠球海绵体肌和坐骨海绵体肌注射后,逆行示踪标记的运动神经元分布于L5和L6脊髓前角的背内侧核和背外侧核内侧部.SP能纤维广泛分布于脊髓灰质,其中以后角为密集.光镜下可见在前角的背内侧核和背外侧核内,SP阳性纤维呈点状和带有钮扣状膨大的纤维分布于逆行标记的运动神经元周围.电镜下可见SP阳性纤维终末含有少量的大型囊泡和多量的清亮小泡.常见SP阳性纤维末梢与HRP逆行标记的运动神经元有紧密联系,并证明二者形成突触结构.本研究首次证实脑下行P物质阳性纤维对调控球海绵体肌和坐骨海绵体肌运动神经元有直接支配关系,提示P物质能纤维参与阴茎勃起和射精过程.
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三色染色法和免疫细胞化学法显示培养的神经轴索及雪旺细胞
本研究目的在于用三色染色法和免疫细胞化学反应显示培养的周围神经中的轴索及雪旺细胞。将大鼠背根神经节体外培养于聚吡咯膜上2周；用苏木精、固绿FCF、变色素2R及磷钨酸等配制的染色液染色；或用抗S-100蛋白和抗神经微丝蛋白抗体进行免疫细胞化学法反应。结果证明，在三色染色法中神经节神经元发出的长突起呈蓝绿色，细胞核呈红色或紫红色，胞质呈浅灰色。免疫细胞化学反应证明神经节发出的长突起为轴索，紫红色核和浅灰色胞质的细胞为雪旺细胞。本文结果提示，三色染色法能区别显示培养的周围神经组织中的轴索及雪旺细胞。
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UVB致成纤维细胞损伤及两种中药的保护作用研究
目的观察中波紫外线(UVB)辐射后成纤维细胞(FB)DNA光产物环丁烷嘧啶二聚体(CPDs)产生和清除情况及表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和黄芩甙的干预作用.方法以30,60,90mJ/cm2UVB照射FB并予EGCG及黄芩甙干预处理,采用免疫细胞化学法在照光后不同时间检测CPDs的产生和清除情况.结果细胞损伤程度随照光剂量加大而加重;30 mJ/cm2UVB照射后细胞CPDs生成量在辐射后1 h左右达到高峰,同时细胞也开始清除CP-Ds,辐射后4 h内清除速率较快,4 h后清除速率逐渐降低,至24 h基本清除CPDs;EGCG和黄芩甙处理UVB辐射的细胞CPDs少于单纯照光组(P＜0.05).结论UVB辐射可以导致FB的DNA损伤而产生光产物CPDs;细胞损伤程度显示剂量依赖性;细胞自身有修复能力;EGCG和黄芩甙均可降低UVB辐射所致的光产物水平.
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豚鼠早期实验性近视眼视网膜色素上皮细胞 bFGF表达变化的研究
目的：研究豚鼠早期实验性近视眼视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞前部及后极部碱性成纤维细胞生长因子( basic fibroblast growth factor,bFGF)的改变,探索近视的发病机制。方法：两周龄豚鼠30只随机分为A组、B组、C组,每组10只,再随机选取5只10眼正常两周龄豚鼠不作任何干预,作为正常对照眼。选取任意眼戴一-10.00 D凹透镜,分别饲养6、15、30 d后除去镜片,验光及测眼轴长度确定近视形成后,采用细胞酶消化法培养豚鼠的前部及后极部RPE细胞,取3~6代RPE细胞进行免疫细胞化学、实时荧光定量PCR、Western-blot蛋白印迹法检查前部及后极部RPE细胞中bFGF表达变化。结果：bFGF的表达定位于细胞浆和细胞核。免疫细胞化学、实时荧光定量PCR、Western-blot蛋白印迹法结果均表明：A、B、C三组实验眼和对照眼前部及后极部RPE细胞均有bFGF的表达,实验组前部及后极部与对照组相应前部及后极部比较,实验组中bFGF的阳性率低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)；而且,随着诱导时间的推移,实验组的阳性率逐渐降低,差异有统计学意义(P<0.05),对照组的阳性率不变,差异无统计学意义(P>0.05)；但实验组和对照组各组自身前部及后极部比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论：实验组前部及后极部与对照组相应前部及后极部比较,bFGF的表达显著低于对照组。
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人牙周膜干细胞的体外分离、纯化及初步鉴定
目的:体外分离纯化人牙周膜干细胞,研究其生物学特性及表型特点并进行初步鉴定.方法:采用胶原酶和Dispase酶联合消化法培养人牙周膜干细胞,有限稀释法分离纯化,将克隆形成的细胞通过透射电镜观察其超微结构、流式细胞仪细胞周期分析及免疫组织化学染色技术检测抗波形丝蛋白(Vimentin)、STRO-1、骨粘素(ON)、骨涎蛋白(BSP)的表达. 结果:获得纯化人牙周膜干细胞,在透射电镜下,这种细胞核质比例大,核大,细胞器少;流式细胞仪细胞周期分析大多数细胞处于G0/G1期,为慢周期性;该细胞抗波形丝蛋白、STRO-1表达阳性、骨粘连素、骨桥蛋白弱阳性表达. 结论:提供了比较有效的分离纯化牙周膜干细胞的方法.该方法分离的人牙周膜干细胞具有干细胞的超微结构、细胞周期及表型特点.
