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ADAM28反义核酸对人牙囊细胞内ADAM28表达的影响
目的 探讨金属蛋白酶解离素28(ADAM28)反义核酸对人牙囊细胞(HDFC)内ADAM28蛋白表达的影响.方法 应用反义核酸技术,设计并合成与ADAM28 mRNA特异序列互补的AS-ODN和正义对照S-ODN转染HDFC后,通过免疫细胞化学、RT-PCR和Western blot检测细胞中ADAM28的表达差异.结果 ADAM28 AS-ODN转染HDFC后,在转录、翻译和蛋白水平细胞内ADAM28的表达均明显减弱,统计学分析有显著性差异(P＜0.01).结论 ADAM28 AS-ODN可有效封闭HDFC内ADAM28的表达.
关键词： 金属蛋白酶解离素28 反义核酸 人牙囊细胞 表达差异 -
ADAM28基因对人牙囊细胞生物学特性的影响
目的 探讨ADAM28基因对人牙囊细胞(HDFC)增殖、分化等生物学特性的影响及可能的作用机制.方法 应用基因重组技术、细胞培养、基因转染、四唑盐比色法(MTT)、流式细胞术(FCM)和酶动力学方法探讨ADAM28基因对HDFC生物学特性的影响.结果 成功构建并转染ADAM28真核质粒,系列检测显示:真核质粒转染组HDFC的增殖活性、增殖指数、ALP分泌活性明显高于空载体组及未转染组(P＜001).结论 ADAM28可显著促进HDFC的增殖和ALP的分泌,并可能同时激活Notch信号途径.参与调控HDFC的增殖、分化和矿化.
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牙骨质附着蛋白对牙囊细胞增殖的影响
目的:了解牙骨质附着蛋白对牙囊细胞增殖的作用.方法:分别采用MTT比色法和酶动力学方法观察牛牙骨质附着蛋白对体外培养人牙囊细胞增殖及其碱性磷酸酶活性影响.结果:牙骨质附着蛋白对牙囊细胞的增殖无显著影响,但高浓度的牙骨质附着蛋白可增强牙囊细胞碱性磷酸酶活性.结论:牙骨质附着蛋白对牙囊细胞的增殖无促进作用.
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ADAM28反义核酸对人牙囊细胞生物学特性的影响
目的:研究ADAM28反义核酸(AS-ODN)对人牙囊细胞(HDFC)增殖、分化、凋亡等生物学特性的影响.方法:采用细胞培养、基因转染、四唑盐(MTT)比色法、酶动力学方法和流式细胞术(FCM)检测ADAM28反义核酸转染HDFC后对细胞生物学特性的影响.结果:ADAM28 AS-ODN组HDFC的增殖活性、增殖指数、碱性磷酸酶(ALP)分泌活性显著降低,凋亡细胞百分比明显上升.结论:ADAM28反义核酸可显著抑制HDFC的增殖和ALP的活性,显著诱导HDFC的凋亡并影响细胞周期的变化.
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人牙囊细胞中表皮生长因子的表达以及流体静压力下的改变
目的:研究体外培养的人牙囊细胞EGF的表达以及在不同流体静压力作用下对细胞分泌EGF的影响,探讨EGF在牙齿萌出过程中的作用.方法:取年龄为12岁男孩埋藏阻生牙齿的牙囊进行人牙囊细胞培养,将传代的培养细胞应用原位杂交的方法表达EGF,RT-PCR定量分析,分别在50、100 kPa流体静压力作用1 h后RT-PCR方法观察细胞EGF的浓度变化.结果:培养的人牙囊细胞呈梭形,主要为成纤维样细胞,原位杂交染色显示人牙囊细胞中EGF的表达呈阳性,定位于细胞的胞质中,50 kPa流体静压力表达略有增加,100 kPa压力表达明显降低,说明流体静压力在一定力值范围内对人牙囊细胞中有EGF的表达具有空间性.结论:培养的人牙囊细胞具有合成与分泌EGF的能力,流体静压力可以影响体外培养的人牙囊细胞EGF的分泌.
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人牙囊细胞的培养及其特性
目的:体外培养人牙囊细胞并研究其特性.方法:取年龄为12岁人埋藏阻生第三磨牙的牙囊,组织块法进行人牙囊细胞的培养,HE染色、扫描电镜观察人牙囊细胞的形态,免疫组织化学染色技术观察Ⅰ型胶原及波形蛋白在牙囊细胞中的表达及定位.结果:培养的人牙囊细胞呈梭形、卵圆形及多角形,形似成纤维细胞;扫描电镜可见细胞多呈梭形,也可见多角形,所有细胞表面均有颗粒状物质,有的细胞表面多且密,有的细胞表面较少,折光性较强,细胞核周围分布较多;在牙囊细胞中Ⅰ型胶原和波形蛋白的表达呈阳性,定位于细胞的胞质中,围绕细胞核周围染色较强,细胞核内染色阴性.结论:体外可以培养人牙囊细胞,人牙囊细胞具有成纤维细胞的特性,具有合成Ⅰ型胶原的能力.
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白细胞介素-10对人牙囊细胞OPG表达的影响
目的:研究人牙囊细胞白细胞介素-10(IL-10)蛋白的表达及其对骨保护素(osteoprotegerin,OPG)表达的影响.方法:采用组织块加胶原酶消化法培养人牙囊细胞,进行IL-10免疫组化染色.将25 ng/ml IL-10作用于牙囊细胞0 h、1 h、3 h、6 h、9 h,用ELISA法检测上清液中OPG含量变化.结果:人牙囊细胞IL-10表达阳性.25 ng/ml IL-10作用于人牙囊细胞3～6 h OPG表达显著增加(p＜0.05).结论:人牙囊细胞表达IL-10,IL-10通过增加人牙囊细胞OPG表达,在牙齿萌出过程中起重要的调控作用.
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人牙囊细胞的体外分离、培养及表型鉴定
目的:建立人牙囊细胞( dental follicle cells,DFCs)的体外培养方法,为牙周组织工程研究提供可靠的种子细胞来源.方法:分离人8月龄胚胎下颌磨牙牙胚,胰酶消化后分离牙囊组织,采用胶原酶消化法和组织块法相结合原代培养人牙囊细胞,利用牙囊细胞和上皮根鞘细胞对胰酶的耐受性差别分离纯化,通过倒置显微镜及HE 染色观察细胞形态及生长状况、透射电镜观察细胞的超微结构;采用免疫组化波形丝蛋白(vimemtin,Vim)、角蛋白(cytokeration,CK)、Ⅰ型胶原(typeⅠcollagen, ColⅠ)、Ⅲ型胶原(type Ⅲ collagen,Col Ⅲ)、纤维连接蛋白(fibronectin,FN)和早期矿化相关的标志骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨涎蛋白(bone sialapretion,BSP)的表达情况对细胞做表型鉴定.结果:原代培养的人牙囊细胞生长良好,但其中混有少量上皮根鞘细胞,经传代可完全分离,传至11代仍保持原有活力;牙囊细胞为长梭型,成纤维样;电镜下见细胞核浆比例大,核仁明显,含有溶酶体、大量的粗面内质网和发达的高尔基体,含有大量的中间丝.电镜结果显示细胞代谢旺盛,增殖活性高,含有牙囊细胞特有的高密度电子颗粒,免疫组化Vim、ColⅠ、ColⅢ、FN、OPN、BSP呈阳性着色,抗角蛋白呈阴性着色.结论:本实验培养的是牙囊细胞,体外培养的人牙囊细胞在较长时间内可保持其特性,细胞具有成骨细胞的某些表型特征,有望成为牙周组织工程研究的种子细胞.
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流体静压力作用下人牙囊细胞CSF-1的表达
目的:研究体外培养的人牙囊细胞在不同流体静压力作用下对细胞分泌CSF-1的影响,探讨CSF-1在牙齿萌出过程中的作用.方法: 取12岁男孩埋藏阻生牙齿的牙囊进行人牙囊细胞培养,将传代的培养细胞分别在50、100、150、200 kPa流体静压力作用1 h后再分别培养24、48、72 h,使用ELISA方法观察细胞培养液中CSF-1的浓度.结果: 培养的人牙囊细胞呈梭形,主要为成纤维样细胞,细胞免疫组化染色显示人牙囊细胞中CSF-1的表达呈阳性,定位于细胞的胞质中,随流体静压力的增大染色增强,随压力的增大而增强.ELISA检测的CSF-1浓度随流体静压力的增大而增加,在一定的时间段内也随培养时间的延长而增加,具有时间性.结论:培养的人牙囊细胞具有合成与分泌CSF-1的能力,流体静压力可以促进体外培养的人牙囊细胞CSF-1的分泌.
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体外培养人牙囊细胞的生物学特性
目的 研究体外培养的人牙囊细胞的生物学特性.方法 分离18岁人埋伏阻生下颌第三磨牙的牙囊,组织块法进行人牙囊细胞的培养,取不同代数细胞行HE染色观察细胞形态,MTS四唑盐比色法检测细胞增殖活性,茜素红染色定量分析成骨能力.结果 第9代细胞面积比第3代、第6代细胞面积显著增大(P＜0.05);第3、6、9代细胞增殖活性两两比较,差异有统计学意义(P＜0.05);第3代细胞成骨能力明显强于第6代细胞(P＜0.05).结论 随着体外培养代数的增加,人牙囊细胞生物学特征发生明显变化,面积逐渐增大,增殖活性逐渐变缓,成骨分化潜力逐渐减弱.
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ADAM28反义核酸对人牙囊细胞表达细胞外基质蛋白的影响
目的 研究ADAM28反义核酸(AS-ODN)转染人牙囊细胞(HDFC)后,对其表达多种细胞外基质蛋白(BSP,OPN,DSPP,Collagen Ⅰ/Ⅲ)的影响.方法 采用细胞培养、基因转染、免疫细胞化学和图像分析技术检测ADAM28反义核酸对HDFC表达上述基质蛋白的影响.结果 ADAM28反义核酸转染HDFC后可显著抑制BSP、CollagenⅢ的表达(P<0.01);对OPN,DSPP,Collagen Ⅰ的表达无显著影响(P>0.05).结论 ADAM28反义核酸可有效封闭人牙囊细胞内BSP、CollagenⅢ的表达.
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神经营养素3促进人牙囊细胞成骨分化
目的 研究神经营养素3(NT-3)对人牙囊细胞(hDFCs)成骨分化的影响.方法 体外分离并培养hDFCs,免疫细胞化学染色法鉴定细胞来源,CCK-8法检测不同质量浓度NT-3对hDFCs增殖活性的影响,同时检测NT-3对hDFCs的碱性磷酸酶(ALP)活性,以及骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、骨钙素(OCN) mRNA相对表达量的影响,并用茜素红染色法检测矿化情况.结果 波形丝蛋白和角蛋白染色结果表明hDFCs为间充质细胞来源.NT-3对hDFCs增殖活性无明显影响;当NT-3质量浓度为25、50、100 ng·mL-1时能明显增强ALP活性,提高BMP-2、OCN mRNA的相对表达量,与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05),NT-3质量浓度为100 ng·mL-1时BMP-2、OCN mRNA的相对表达量达到高.当NT-3质量浓度为50、100 ng·mL-1时矿化结节数量多.结论 适宜质量浓度的NT-3能促进hDFCs的成骨分化.
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低氧对人牙囊细胞生:学特性的影响
目的 研究低氧对人牙囊细胞(hDFCs)生物学特性的影响.方法 利用组织块酶消化法从年轻恒牙中分离培养hDFCs;采用免疫荧光技术检测细胞表面标志物,多向诱导实验检测细胞多向分化潜能;模拟体外低氧微环境,将细胞分为常氧组(20%O2)和低氧组(2%O2),分别对两组细胞行Transwell小室试验检测低氧对细胞迁移的影响,采用CCK-8法检测低氧对细胞增殖的影响.通过实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和Western blot分别从基因和蛋白水平检测hDFCs多能性相关标志物于不同氧体积分数下的表达;分别对两组细胞进行成骨诱导,qRT-PCR检测成骨相关基因,茜素红染色评估矿化结节的形成.结果 hDFCs具有较强的干细胞特征,具有成骨、成脂及成神经多向分化能力,符合间充质干细胞基本标准,能够满足牙组织工程构建对种子细胞的需求.低氧有利于hDFCs多能性的保持,同时促进了hDFCs的迁移和增殖.hDFCs于低氧中进行诱导时,其成骨分化能力得到增强.结论 低氧微环境对维持hDFCs多能性,促进hDFCs增殖、迁移和分化有重要作用.
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体外培养观察人牙囊细胞中细胞程序性死亡及其在不同流体静压力下的变化
目的 研究体外培养的人牙囊细胞的特征,以及在不同流体静压力作用下细胞程序性死亡(PCD)的改变,探讨PCD在牙齿萌出过程中的作用.方法 取12岁男孩埋伏阻生牙齿的牙囊进行人牙囊细胞培养,将传代的培养细胞应用TUNEL的方法标记PCD细胞,分别在50kPa和100kPa流体静压力作用1 h后观察PCD变化,以不加压的人牙囊细胞作为对照.结果 体外培养的人牙囊细胞呈梭形、纺锤形或多角形,具有成纤维细胞特征.在50kPa流体静压力下人牙囊细胞PCD阳性细胞率与对照组无统计学差异(P＞0.05),而100kPa流体静压力下PCD阳性细胞率较对照组增加了31.65%,有统计学差异(P＜0.01).结论 流体静压力可以影响体外培养的人牙囊细胞的程序性死亡.
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白细胞介素-10对人牙囊细胞RANKL表达的影响
目的:研究人牙囊细胞白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)蛋白的表达及其对破骨细胞分化因子(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand,RANKL)表达的影响.方法:采用组织块加胶原酶消化法培养人牙囊细胞,进行IL-10免疫组化染色.2 5ng/m1IL-10作用于牙囊细胞0、1、3、6 h,用RT-PCR检测RANKL mRNA表达的变化.结果:人牙囊细胞IL-10表达阳性.25ng/ml IL-1 0降低人牙囊细胞PANKL的表达,且具有时间依赖性.结论:人牙囊细胞表达IL-10,IL-10通过降低人牙囊细胞RANKL的表达,在牙齿萌出过程中起重要的调控作用.
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人牙囊细胞的分离培养和生物学特性
目的:应用酶消化法体外培养人牙囊细胞并研究其生物学特性.方法:分离合法引产人胚胎乳牙胚的牙囊组织,消化法获得人牙囊细胞,HE染色观察细胞形态、免疫组织化学染色技术检测波形丝蛋白、Ⅰ型胶原表达,RT-PCR检测细胞的骨钙素、骨涎蛋白、碱性磷酸酶的表达.结果:原代培养的人牙囊细胞呈成纤维细胞形态,有部分上皮成分混杂,经纯化后可排除;在牙囊细胞中Ⅰ型胶原和波形丝蛋白的表达呈阳性,定位于细胞的胞质中;RT-PCR结果显示骨涎蛋白、骨钙素、碱性磷酸酶表达.结论:体外培养的人牙囊细胞具有成纤维细胞的特性,具有合成Ⅰ型胶原的能力;不同程度表达Ⅰ型胶原、骨钙素、骨涎蛋白、碱性磷酸酶等矿化相关蛋白.
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体外培养人牙囊细胞Ⅰ型胶原与纤维粘连蛋白的表达
目的:通过体外培养人牙囊细胞,研究Ⅰ型胶原与纤维粘连蛋白在细胞中的表达,探讨其在牙齿萌出过程中转化为牙周膜细胞的机制.方法:取12岁患者因正畸需要拔除埋藏阻生牙齿的牙囊,组织块法进行人牙囊细胞的培养,通过免疫组织化学染色技术观察Ⅰ型胶原及纤维粘连蛋白在牙囊细胞中的表达及定位.结果:培养的人牙囊细胞呈梭形、卵圆形及多角形,形似成纤维细胞.在牙囊细胞中Ⅰ型胶原和纤维粘连蛋白的表达呈阳性,定位于细胞的胞质中,围绕细胞核周围染色较强,细胞核内染色阴性.结论:体外培养人牙囊细胞具有成纤维细胞的特性,具有合成与分泌Ⅰ型胶原与纤维粘连蛋白的能力.
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集落刺激因子在人牙囊细胞中的表达
目的:研究体外培养的人牙囊细胞中集落刺激因子(CSF-1)表达及定位,以及不同浓度的IL-1α对牙囊细胞分泌CSF-1的影响,探讨CSF-1在牙齿萌出中的作用.方法:取12岁患者因正畸需要拔除的埋藏阻生牙齿的牙囊进行人牙囊细胞培养,用免疫组织化学染色技术,观察CSF-1在细胞中的表达及定位.使用ELISA方法观察0～100ng/ml的五个不同浓度的IL-1α对培养的牙囊细胞分泌CSF-1的影响.结果:培养的人牙囊细胞呈梭形,主要为成纤维样细胞,在牙囊细胞中CSF-1的表达呈阳性,定位于细胞的胞质中,围绕细胞核周围染色较强,细胞核内染色阴性,细胞外未见阳性表达.培养细胞加入IL-1α后,CSF-1的浓度明显增加并随IL-1α浓度的增加而增加.结论:培养的人牙囊成纤维样细胞具有合成与分泌CSF-1的能力,IL-1α可以促进体外培养的人牙囊细胞CSF-1的分泌.
