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内皮素-1体外对人小梁细胞骨架肌动蛋白的影响
目的:观察内皮素-1(endothelin-1,ET-1)对人眼小梁细胞细胞骨架肌动蛋白的影响.方法:培养3代人眼小梁细胞,随机分为4组:对照组(0mol/L ET-1);ET-1低剂量组(10-9mol/L ET-1);ET-1中剂量组(10-8mol/L ET-1);ET-1高剂量组(10-7mol/L ET-1),各组细胞分别处理72h后,应用Western-blot方法检测小梁细胞骨架肌动蛋白(F-actin)的表达,并用FITC-phalloidin荧光探针观察肌动蛋白在细胞内的分布.结果:ET-1作用后人小梁细胞肌动蛋白表达明显增高,在10-9～10-7mol/L浓度范围内呈剂量依耐性,荧光探针示ET-1处理组小梁细胞肌动蛋白应力纤维和周边肌动蛋白明显增多浓集,细胞微丝附着与胞膜,细胞间连接及细胞贴壁部位连接明显增多.结论:ET-1能促进小梁细胞肌动蛋白表达,参与了小梁细胞骨架的重构.
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剪切力对视网膜色素上皮细胞syndecan-1,血管细胞黏附分子-1,E-选择素蛋白表达和肌动蛋白的影响
目的:研究剪切力对视网膜色素上皮(RPE)细胞syndecan-1,血管细胞黏附分子(VCAM)-1和E-选择素(selectin)表达和细胞骨架的影响.方法:体外培养人RPE细胞,应用2 dyns/cm2大小的剪切力干预0,0.25,0.5,0.75,1,1.5,3 h后,用免疫荧光染色法观察RPE细胞syndecan-1,VCAM-1和E-selectin表达和肌动蛋白的变化.结果:静态下的RPE细胞呈多角形和不规则形.2dyns/cm2剪切力作用0.75 h后,细胞间隙加大,部分细胞形状变圆、变小;作用后1.5 h,细胞极性改至与剪切力作用方向致.静态条件下,肌动蛋白呈黄绿色丝状分布于中央细胞内,排列松散不规则且微丝较细;剪切力作用3 h后,肌动蛋白增多增粗,且沿切力方向排列于中央和远周边细胞.剪切力作用后,RPE细胞syndecan-1的表达在0.5 h时弱,1 h时强;VCAM-1的表达在0.5 h时弱,1.5 h时强;E-selectin的表达在0.75 h时低,3 h时高.结论:剪切力可引起RPE细胞syndecan-1,VCAM-1和E-selectin及细胞骨架蛋白发生变化,它们之间的相互协作对RPE细胞的形态、黏附和力学信号转导起重要作用.
关键词： 剪切力 Syndecan-1 VCAM-1 E-selectin 色素上皮 眼 肌动蛋白 -
人视网膜微血管周细胞原代培养及鉴定
目的:建立人视网膜微血管周细胞的培养方法并研究体外其免疫组化特征.方法:由人微血管片断生长出的周细胞首先通过其形态及生长方式进行鉴别,采用含有200mL/L胎牛血清的DMEM培养基于未包被培养瓶培养;非周细胞例如色素上皮细胞可机械除杂;周细胞特征性的标志物通过免疫组化和激光共聚焦显微镜评价.人视网膜微血管周细胞的生长曲线通过MTT法测定.结果:在这样的培养条件下,周细胞1～2d由微血管片断游出,1wk可形成较大克隆,大约2wk可融合成单层细胞.这些细胞为高度不规则形,重叠生长方式,没有接触抑制;表达α-平滑肌肌动蛋白,肌动蛋白以及3G5阳性;不含有von Willebrand因子和角蛋白;周细胞可部分混杂其他细胞,纯度为99%;周细胞可持续生长并传代.结论:本研究为首次报道人源性视网膜微血管周细胞的培养及鉴定.本培养实验为研究人眼异常血管疾病提供了新的平台.
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人视网膜色素上皮细胞在电场中定向移行的实验研究
目的:观察外源性电场对培养人视网膜色素上皮(human retinal pigment epithelial,hRPE)细胞移行方向及细胞内肌动蛋白表达的影响.方法:培养于DMEM+100g/L FBS的hRPE细胞暴露于强度为6V/cm的电场中,未暴露于电场的细胞作为对照.观察并记录2h中每隔15min细胞移行的变化图像,测量细胞移行距离、细胞移行方向及其与场线间夹角.2h后采用间接免疫荧光法检测实验组与对照组细胞内肌动蛋白表达情况.SPSS10.0及Image-Pro Plus5.0软件处理结果.结果:未暴露于电场中的hRPE细胞在观察期间呈无序移行,2h后细胞分布未见特殊变化,细胞内肌动蛋白有弱阳性表达.细胞暴露于电场30min后开始出现阴极方向的移行趋势,大部分细胞长轴趋向垂直于场线方向排列.细胞的移行表现为移行速度和移行方向的一致性均随时间延长而增加(P＜0.05).暴露于电场2h后,大部分细胞内肌动蛋白表达阳性,且多集中分布于细胞质内朝向电场阴极一侧.结论:外加电场可诱导hRPE细胞向电场阴极方向定向移行,同时伴有细胞内肌动蛋白阳性表达及定向分布.电场对细胞的作用与暴露时间成正相关.视网膜脱离后的内源性电场的存在可能参与并诱导了RPE细胞的定向移行.
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不同扩张方式对扩张皮肤胶原纤维和肌动蛋白的影响
目的:探讨不同扩张方式对皮肤胶原纤维和肌动蛋白的影响,为临床上寻找合适的扩张方式提供实验依据.方法:选用随机分组法,将实验兔分为反复快速扩张组(A组)、快速扩张组(B组)、常规扩张组(C组)、埋入不扩张组(D组)、正常对照组(E组).实验组埋植扩张器并进行不同方法的扩张,不同的维持期取材.应用特殊染色法检测皮肤中Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维的含量及其比值;应用免疫组化检测肌动蛋白的表达.结果: A、B、C组早期以I型胶原纤维为主且较粗大,排列较为紊乱,III型胶原纤维相对较少.4 周后, I型胶原纤维排列逐渐规律,Ⅲ胶原纤维相对增加. Ⅰ、Ⅲ型胶原面积比较:相同维持期A、B、C组间差异无显著性;A、B 2 组随着维持期的延长呈增长趋势,4 周后趋于稳定.C组随着维持期的延长呈增长趋势,3 周后趋于稳定.I/III型胶原比值比较:A、B 2 组在前3 周时,与E组相比差异有显著性,在4 周后差异无显著性;C组在前2 周时差异有显著性,在3 周后差异无显著性.A、B、C 3 组内肌动蛋白阳性率随着维持期的延长呈下降趋势.相同维持期A、B、C 3 组间比较:B组>A组>C组,经统计学分析,前3 周时,3 组间差异均有显著性;在4 周时A、C 2 组间差异已无显著性,但在4～6 周时A、 B 2 组间差异仍有显著性.结论:反复快速扩张可缩短疗程,并能获得高质量的皮肤,是一种安全可行的扩张方法.
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肌动蛋白在大鼠磨牙及其发育中的分布研究
目的:探讨肌动蛋白在大鼠磨牙及其发育中的时空分布及意义.方法:建立大鼠牙胚发育模型,用免疫组化方法检测肌动蛋白在成年和发育期磨牙中的表达.结果:肌动蛋白在钟状期外釉上皮细胞、分泌前期成釉细胞和成牙本质细胞及中间层细胞之间、硬组织形成期成釉细胞Tomes'突和成牙本质细胞胞浆呈阳性表达.结论:肌动蛋白在大鼠磨牙发育过程中的分布具有时空特异性,与细胞的分化程度和功能状态密切相关.
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铁缺乏对大鼠畸变产物耳声发射的影响
目的观察铁缺乏大鼠畸变产物耳声发射(DPOAE)的一般特征及幅值变化,探讨铁缺乏对DPOAE的影响机制. 方法 18只大鼠随机分为正常对照及实验组,缺铁饮食饲养法制备动物模型,实验及动物处死前检测DPOAE,并进行耳蜗肌动蛋白免疫组化检测,分析DPOAE变化及可能机制. 结果铁缺乏组大鼠20个测试耳中,12耳2.0 kHz以上频率点的DPOAE幅值略有降低,耳蜗免疫组化检测显示其外毛细胞的肌动蛋白免疫组化无明显变化;另8耳2.0 kHz以上频率点的幅值下降明显,尤以2.8 kHz处为著,相应的耳蜗免疫组化染色显示外毛细胞肌动蛋白免疫反应活性明显降低. 结论铁缺乏可影响DPOAE幅值,其机制可能与耳蜗听毛细胞肌动蛋白免疫反应活性降低及组织缺氧有关.
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铁缺乏对大鼠耳蜗肌动蛋白影响的实验探讨
目的观察铁缺乏对大鼠耳蜗肌动蛋白的影响, 探讨铁缺乏致聋的发病机制.方法应用SDS-PAGE蛋白电泳、双波长薄层扫描分析、免疫组织化学及听性脑干诱发电位检测 ,对照观察6～8 wk铁缺乏大鼠和正常大鼠耳蜗肌动蛋白含量及分布的变化与听阈变化的关系.结果铁缺乏引起感音神经性聋大鼠耳蜗肌动蛋白相对含量及免疫反应活性均有明显下降.结论耳蜗内肌动蛋白含量减少和(或)免疫反应活性降低是铁缺乏致聋的重要病理基础之一.
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人 CAP1蛋白真核表达及细胞定位与功能
目的：构建 CAP1蛋白真核表达质粒并使之在细胞内得以表达,确定 CAP1蛋白在细胞中的定位及其对细胞迁移的影响。方法以 HeLa 细胞 cDNA 为模板,经 PCR 获取 CAP1编码区 cDNA,将该编码区 cDNA 序列插入 pC-MV-Myc 质粒中,构建带 Myc 标签的真核表达重组质粒。重组质粒转染至293细胞中,Western blot 方法检测其在真核细胞内的表达；重组质粒转染 HeLa 细胞,免疫荧光法检测其细胞内的定位,划痕实验观察其对细胞迁移的影响。结果成功构建了 CAP1真核表达重组质粒,并在真核细胞内成功表达,确定 CAP1定位于细胞质中,划痕实验证明CAP1过表达的细胞迁移能力明显下降。结论在真核细胞中成功表达了 CAP1重组质粒且 CAP1定位于细胞质,其过表达对细胞迁移有抑制作用,为研究 CAP1的生理功能奠定实验基础。
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豚鼠耳蜗螺旋动脉平滑肌细胞的原代培养及鉴定
目的联合2种常用的细胞培养方法从豚鼠耳蜗螺旋动脉中提取平滑肌细胞,为相关实验研究提供材料.方法从豚鼠耳蜗中分离出螺旋动脉,应用1.25 g/L的胰蛋白酶进行消化并将组织块贴壁,运用自然纯化法及根据不同细胞贴壁能力的差异性对细胞进行纯化,通过形态学观察及免疫荧光、免疫组化和Western blot对细胞进行鉴定.结果85％的组织块存活,第4代平滑肌细胞纯度达95％.镜下可见细胞呈典型的"峰-谷"样生长,免疫荧光、免疫组化及Western blot结果显示平滑肌细胞特异性的肌动蛋白呈阳性表达.结论通过本研究方法,可以得到大量高纯度的豚鼠耳蜗螺旋动脉平滑肌细胞,有望为内耳循环系统紊乱导致的病理生理变化的体外研究及血管平滑肌药物评价提供一个理想的研究材料.
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fascin在上皮组织来源恶性肿瘤中的表达及临床意义
fascin基因属于fascins家族，其编码的蛋白质产物fascin蛋白是一种肌动蛋白结合蛋白，主要表达于间叶组织和神经系统。近年来研究发现，很多的人类恶性肿瘤出现fascin蛋白的阳性表达，并且与肿瘤的侵袭转移以及患者的预后密切相关。本文对fascin基因编码的fascin蛋白在不同恶性肿瘤中的表达及其可能存在的调控机制做一简单综述、并探讨其判断患者预后标记物和治疗靶点的前景。
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宿主细胞系用于病毒性疫苗生产初期可行性的比较
为了缩短病毒疫苗研究和生产的时间，应以宿主细胞系作为表达系统来生产抗多组病毒病原体的病毒性疫苗。选择的作为表达系统的各细胞系，就其对于脊灰病毒、A型流感病毒和呼吸道合胞病毒（野生型株A2）复制作用的初期可行性进行比较。研究了6个贴壁细胞系（ Vero、HEK-293、MRC-5、CHO-K1、BHK-21 c13、MDCK ）和6个单细胞悬浮式细胞系（ CAP、AGE1、CR ．HS、sCHO-K1、BHK-21 c132 p、MDCK SFS ）它们增殖病毒的能力。第一，测定了细胞大密度，第二，用流式细胞计量术和免疫细胞化学监测了分配有8种不同病毒受体的细胞系的病毒受体表达与极化作用。通过用编码肌动蛋白-EGFP的构建物LifeactTM 转染细胞研究了肌动蛋白细胞骨架的组织。后，测定了每一个细胞系生产所研究病毒的子代的能力。结果表明，培养于无血清培养基的单细胞悬浮细胞系是好的用于病毒复制的宿主细胞系候选者。
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心肌钙蛋白基础概念及临床应用
心脏标志物(Cardiac Markers，下称心标)研究浪潮爆发于90年代。经芝加哥和路易斯维尔两次专题会议，百名学者评论修订之后，美国临床生化学会(National Academy of Clinical Biochemistry,NACB)于1999年7月正式公布了冠状动脉疾病使用心标的推荐书。用心肌钙蛋白(Cardiac Troponin，cTn)作为新的金标准取代CK-MB乃至整个心肌酶谱，协助心脏、急诊和全科医师对急性冠脉综合征(Acute Coronary Syndromes,ACS)患者进行诊治和危险分层以改善其临床结局已成必然趋势。我国学者敏锐地感知这一重大转变并及时予以引进。现就新近文献所见对cTn进展简介如下。1 肌钙蛋白组成、功能及分类 肌钙蛋白(Troponin,Tn)是由C、T、I三个亚基组成的一种复合体，定位于骨骼肌和心肌的细肌丝上，调节肌肉的收缩。T和原肌球蛋白(Tropomyosin)结合将Tn和肌动蛋白细肌丝联接在一起，被认为具有定位作用。Tn中的I亚基抑制细肌丝中肌动球蛋白(Actomyosin)ATP酶活性，防止无Ca时肌肉收缩。C是Tn复合体中的Ca结合亚基，其N端与Ca结合后诱导构象改变，阻断TnI的抑制作用，触发肌肉收缩。
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人瘢痕组织中钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶的表达
1 对象与方法1.1 主要试剂和仪器兔抗人钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶(CASK)多克隆抗体、兔抗人β肌动蛋白单克隆抗体、辣根过氧化物盒标记的山羊抗兔多克隆抗体、增强型化学发光(ECL)试剂盒(美国Santa Cruz公司),二辛丁酸试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司),聚偏二氟乙烯膜(美国Millipore公司).酶标仪(奥地利Anthosht公司),电泳仪、凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司).
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大鼠烫伤后早期转化生长因子β1/Smads信号通路的活化
1材料与方法1.1 主要试剂来源一抗:小鼠抗大鼠β肌动蛋白单克隆抗体(美国Sigma公司),山羊抗大鼠磷酸化Smad 2/3多克隆抗体、兔抗大鼠Smad 3多克隆抗体(美国Santa Cruz公司);二抗:辣根过氧化物酶(HRP)标记的驴抗兔或山羊多克隆抗体(美国Santa Cruz公司),HRP标记的山羊抗小鼠多克隆抗体(美国Calbiochem公司).
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改良人脱细胞真皮基质对成纤维细胞Ⅰ型前胶原mRNA表达的影响
主要试剂和仪器:hoechst 33258购自美国Sigma公司,鼠抗人波形蛋白抗体、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗小鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒购自大连宝生物工程有限公司,β肌动蛋白、Ⅰ型前胶原引物购自上海博亚生物技术有限公司.IX71型荧光显微镜购自日本Olympus公司,PCR扩增仪购自德国Eppendorf公司.
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生长相关蛋白与神经发育、可塑性和再生的关系
神经系统发育过程中,轴突的方向性生长是形成复杂而严密的神经网络所必需的要素.轴突之所以能沿适当的路径生长,正确识别靶细胞并与之建立突触联系,结构-生长锥发挥了重要的作用.生长中的轴芽尖端膨大,形成一个富含肌动蛋白的丝状伪足样结构,称为生长锥(growth cones).生长锥的丝状伪足端用来探测远侧环境,若接触到可以粘附的基质,丝状伪足的尖端则粘附在基质结构上并牵拉整个生长锥向远侧粘附部位移动.生长锥如何沿伸向一定的部位,曾有不同的学说.
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体外着床模型中人孵化后早胚细胞角蛋白和肌动蛋白的表达
目的:建立理想的体外胚胎着床模型,并检测模型中人孵化后早胚细胞角蛋白、肌动蛋白和hCG.方法:孵化后早胚与人子宫内膜蜕膜化的基质细胞共培养,观察胚泡在基质细胞层上的定位、黏附、铺展和侵入过程;用免疫荧光染色技术,测定共培养系统中的细胞角蛋白和肌动蛋白;用免疫荧光分析技术,测定培养液中的hCG水平.结果:胚泡和基质细胞共培养5 h起,胚泡开黏附在基质细胞层上,终侵入蜕膜化的基质细胞间.共培养48 h后,细胞角蛋白仅仅在滋养层细胞中表达;肌动蛋白在人蜕膜化的基质细胞和滋养层细胞中均有表达.囊胚与子宫内膜基质细胞共培养的培养液中的hCG水平明显高于囊胚单独培养的(P＜0.01).结论:成功建立了一个能反映人胚泡黏附、铺展及侵入到人子宫基质细胞的体外着床模型,细胞角蛋白、肌动蛋白和hCG在着床早胚细胞中起相应变化.
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全反式维甲酸对球囊损伤大鼠胸主动脉VSMC表型变化及增殖的影响
①目的探讨全反式维甲酸(ATRA)对球囊剥脱大鼠胸主动脉内皮后血管平滑肌细胞(VSMC)表型变化及增殖的影响.②方法雄性SD大鼠54只,随机分为3组.ATRA治疗组(n=24)行球囊剥脱大鼠胸主动脉内皮术,术前4 d开始予ATRA芝麻油混悬液(30 mg·kg-1·d-1)灌胃至术后处死;手术组(n=24)行球囊剥脱大鼠胸主动脉内皮术,术前4 d开始予芝麻油(1 mL·kg-1·d-1)灌胃至术后处死;对照组(n=6)除不插入球囊导管外,其他操作同手术组.分别于术后2、7、14、28 d取胸主动脉应用苏木精-伊红染色、免疫组化和计算机图像分析法进行形态学、平滑肌α肌动蛋白(SM-α-actin)和增殖细胞核抗原(PCNA)表达水平检测.③结果正常动脉VSMC高表达SM-α-actin,处于非增殖状态;损伤后中膜SM-α-actin表达迅速下降,2 d达低水平,而增殖旺盛,后趋向正常水平;新生内膜在术后7 d出现,处于高度增殖状态,SM-α-actin含量少,术后14、28 d的SM-α-actin表达明显增多,而增殖下降.ATRA治疗能明显抑制中膜SM-α-actin的下调,诱导内膜和中膜SM-α-actin表达,显著抑制VSMC的迁移和增殖,明显抑制新生内膜形成和管腔缩窄.SM-α-actin表达与PCNA表达呈显著负相关(r=-0.738,P<0.01).④结论维持并诱导VSMC于较高的分化状态,抑制VSMC迁移和增殖,是ATRA抑制球囊损伤大鼠主动脉后新生内膜增生和管腔狭窄的可能机制之一.
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大鼠死后心肌骨骼肌细胞肌动蛋白变化及与死亡时间的关系
目的探讨大鼠死后心肌骨骼肌细胞肌动蛋白的变化及其与死亡时间的关系.方法采用免疫组化S-P法和IBSA图像分析系统,观测大鼠死后不同时间心肌骨骼肌抗肌动蛋白单克隆抗体(HHF35)染色变化.结果在大鼠死后54h内,心肌骨骼肌呈不同程度的HHF35缺染,其面积随死后时间的延长而增大.经对IBSA图像分析数据进行方差分析(F心肌=588.27,F骨骼肌=351.25,P＜0.05),具有显著性差异;经逐步回归分析(r心肌=0.943,r骨骼肌=0.958,P＜0.05),具有正相关关系.所建方程y心肌=-30.568+1.003x1,y骨骼肌=-24.897+0.986x2(X为HHF35缺染面积均数)具有统计学意义.结论在一定时间内,大鼠死后不同时间心肌骨骼肌细胞HHF35缺染面积,随死后时间的延长而增大.
