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大孔GT/PCL电纺材料作为软骨组织工程支架的可行性研究
目的 探讨大孔径GT/PCL电纺材料作为软骨组织工程支架的可行性.方法 取猪耳郭软骨细胞为种子细胞.大孔径GT/PCL电纺纳米材料设为实验组,无纺布GT/PCL电纺纳米材料设为对照组,对二者的形貌特征和孔隙率进行观察比较,在二维平面比较二者与软骨细胞的黏附率和细胞增殖能力,并在三维空间比较软骨细胞的浸润情况.结果 扫描电镜显示,实验组材料孔径明显大于对照组,孔隙率测试数据也支持该结果;二维平面上,两组材料对软骨细胞的黏附和增殖能力无显著性差异,SEM显示实验组软骨细胞可长入材料内部;三维空间中,软骨细胞在实验组的浸润深度明显大于对照组.结论 大孔GT/PCL电纺材料不影响软骨细胞的黏附与增殖,明显利于软骨细胞的长入和浸润,在软骨组织工程的应用上具有良好的前景.
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软骨组织工程的研究进展
目前,软骨组织工程已在基础研究方面取得了令人瞩目的成果,并在临床应用方面进行了初步尝试,为临床软骨缺损的修复提供了新的思路与途径,已经成为该领域主要的研究方向,但其大规模临床应用尚存在诸多困难.现结合近年的研究成果,就组织工程化软骨的种子细胞、生物支架材料、体内外构建以及临床应用等方面进行综述.
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间充质干细胞在关节软骨缺损修复中的应用
外伤或炎症造成的关节软骨缺损在骨科临床十分常见.关节软骨缺损可造成疼痛、关节畸形,甚至严重的功能障碍,严重影响人们的生活质量.传统的软骨修复方法包括软骨下钻孔术、磨削术和微骨折术等,临床疗效欠佳.近年来,越来越多的新方法开始应用于关节软骨缺损的基础与临床研究.其中软骨组织工程作为研究的焦点,正日益受到科研工作者和临床医生的广泛关注.软骨组织工程包括种子细胞的选择、支架材料的应用和培养环境的构造三个方面[1].选择合适的种子细胞对于软骨组织工程至关重要.
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应用于整形外科领域的组织工程化软骨
软骨组织工程的基本技术路线是在体外培养种子细胞,并以一定浓度将其种植于具有良好生物相容性和可降解性的合适支架上,形成细胞-支架复合物,将此复合物植入生物体内组织缺损部位,终完成对组织的修复和再造[1,2].软骨组织工程的应用目前主要集中在两个领域:骨科和整形外科.整形外科软骨组织工程的研究方向与骨科有所不同:就临床常用作修复或填充的器官类型(耳廓、气管、鼻翼、鼻假体、颏假体等)而言,它们属于非承重结构,因而对其在软骨力学方面的要求相对较低.然而,整形外科对于修复体形态的要求则更高、更精确.所以,如何使所预制的支架材料在形成软骨的过程中始终保持其复杂的表面形状是一个更大的挑战.以下就构建适用于整形外科领域的组织工程化软骨的可选择方案做一综述.
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骨髓间充质干细胞和胚胎干细胞向软骨细胞转化可能的分子机制
现代外科的发展将使人类替换体内任一组织的梦想变为现实.软骨属于增殖能力极弱的终末细胞,自1743年Hunter提出软骨一旦破坏即不可自身修复以来,软骨组织的修复一直无理想方法,组织工程概念的提出为解决这一问题带来了曙光.理想的种子细胞获取是软骨组织工程面临的首要问题,目前骨髓间充质干细胞和胚胎干细胞是研究多的两类种子细胞来源,具有较大的潜力,在体内外培养过程中,发现有许多因子在其向软骨细胞分化时发挥调节作用,本文就这方面的研究现状进行综述.
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犬成肌细胞体外向纤维软骨细胞表型分化的实验研究
目的 观察体外培养的犬成肌细胞在诱导培养液作用下向纤维软骨细胞表型分化的可行性.方法 取成年比格犬大腿后群肌肉,以机械分解法与二步酶消化法相结合,分离获取成肌细胞,取第4代成肌细胞,实验组以2.0×104/cm2细胞密度接种于24孔板,在含有人源性软骨源性形态发生蛋白-2(human cartilage-derived morphogenic protein-2,hCDMP-2)的高糖DMEM完全培养液中诱导分化,对照组以相同细胞密度接种于24孔板,加入不含诱导因子的高糖DMEM完全培养液.诱导21 d后,倒置显微镜下观察诱导细胞形态学的改变,H-E染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原蛋白免疫组织化学方法检测诱导细胞的分泌功能,RT-PCR检测Ⅰ型、Ⅱ型胶原蛋白和Sox9的mRNA表达情况.结果 诱导后成肌细胞的形态由长梭形向多角形类、圆形转变.甲苯胺蓝染色呈明显异染,Ⅱ型胶原蛋白免疫细胞化学检测阳性,对照组阴性.RT-PCR检测显示经诱导后细胞Ⅰ型、Ⅱ型胶原蛋白和Sox9的mRNA在对应区域均有目的条带出现,而对照组未见明显的目的条带亮带.结论 在hCDMP-2诱导下,犬成肌细胞可定向分化为软骨细胞.
关键词： 成肌细胞 软骨分化 种子细胞 人源性软骨源性形态发生蛋白-2 软骨组织工程 -
负载富血小板纤维蛋白的新型水凝胶对BMSCs体外成软骨分化的影响
目的:探究负载富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)的新型水凝胶对骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)体外成软骨分化的影响.方法:配制体积比为6:1:1的2%壳聚糖/56%β-甘油磷酸钠/0.1%京尼平混合液,置于37℃恒温水浴箱后观察其成胶时间;通过一次离心法(1200 r/min,12 min)制备PRF,将PRF冻干研磨成粉后加入上述混合液,置于37℃制备负载PRF的新型水凝胶.接种BMSCs于水凝胶表面,培养1、3、7 d后通过二乙酸荧光素(fluoresceindiacetate,FDA)荧光染色观察其增殖情况;再将细胞接种于24孔板,分为负载PRF的新型水凝胶组(PRF组)、壳聚糖水凝胶组(壳聚糖组)以及单纯诱导组,分别添加适量材料后进行成软骨诱导,第2周结束时每组取12孔分别进行HE染色、番红O-固绿染色、阿利新蓝染色、兔Ⅱ型胶原免疫组化染色观察软骨分化情况;其余细胞诱导至第4周结束,阿利新蓝比色法和ELISA法检测每周收集上清液中糖胺聚糖及Ⅱ型胶原含量.结果:壳聚糖/β-甘油磷酸钠/0.1%京尼平混合液在37℃下约8 min能够成胶;FDA荧光染色显示BMSCs在水凝胶表面增殖良好;4种染色结果显示PRF组均呈阳性,壳聚糖组和单纯诱导组呈弱阳性;3组上清液均含有糖胺聚糖和Ⅱ型胶原,PRF组分泌量在4周内均显著高于其他两组(P均<0.05).结论:BMSCs能够在负载PRF的新型水凝胶表面生长、增殖,细胞相容性较好;该水凝胶能在一定程度上促进BMSCs成软骨分化.
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软骨组织工程支架材料的研究进展
软骨组织工程支架材料要求具有特定的生化、物理性质,如极强的生物相容性、合适的生物降解性、可控的孔径大小、足够的孔隙率等.随着软骨组织工程的发展,如何选取理想的支架材料已成为这一课题的关键.文中就近年来软骨组织工程的支架材料研究进展进行综述.
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软骨组织工程的动物实验及临床应用展望
目前,软骨组织工程的动物体内构建实验已进入以免疫器官发育完全的大型哺乳动物为主要实验对象的阶段,并初步应用于临床,为软骨缺损的修复提供了新的思路与途径,并可能成为这一领域主要的研究方向,但尚存诸多困难.作者对软骨组织工程的动物体内构建实验和临床应用研究的现状和趋势作一综述.
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大鼠多能成体祖细胞体外成软骨的诱导和鉴定
[目的]探讨大鼠多能成体祖细胞（multipotent adult progenitor cells，MAPCs）在特定培养条件下向软骨细胞定向分化的能力。[方法]分离培养大鼠MAPCs，扩增至第2代，观察其形态学特点，并将其离心成团后分为2组，诱导组应用转化生长因子-β3（transforming growth factor-β3，TGF-β3）、骨形态发生蛋白-6（bone morphogenetic protein-6，BMP-6）、胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factors-1，IGF-1）及地塞米松等进行成软骨诱导分化，对照组用含10%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）的高糖DMEM培养液（dulbecco's modifiedeagle medium high-glucose, H-DMEM）常规培养液自然分化。以Safranin O和Ⅱ型胶原免疫组化染色等进行鉴定，阿尔新蓝比色法测定糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）的含量。[结果]体外定向诱导后MAPCs表现出软骨细胞的特性。诱导组形成了透明软骨样外观的细胞团，而对照组体积小、松散，Ⅱ型胶原免疫组化染色显示诱导组可见成熟软骨陷窝形成，Safranin O染色显示诱导组软骨特异性细胞外基质沉积，诱导组GAG的含量高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。[结论]MAPCs具有良好的成软骨潜能，可以成为软骨组织工程良好的种子细胞来源。
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BMSCs体外分离培养的实验研究
目的 探索一种正确的BMSCs抽取、分离和体外培养方法,建立BMSCs体外培养体系.方法 倒置相差显微镜观察BMSCs细胞生长情况及形态变化特点.结果 培养的BMSCs呈多种形态,有粗细不均的胞质突起,并且呈集落样生长.二代细胞形态更加单一,呈均匀生长,细胞因相互接触而产生接触抑制.大白鼠BMSCs经体外培养后生长活跃,具有良好的形态特征及生长特点.结论 全骨髓贴壁培养法是分离BMSCs的一种比较理想的方法.
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软骨组织工程的历史、现状与未来
组织器官缺损或功能障碍是人类健康的主要危害之一,也是人类疾病和死亡的主要原因.现代医学对组织器官缺损的治疗仍然是以组织器官移植为主要手段的医学治疗模式.
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间充质干细胞的研究进展及其在软骨组织工程中的应用
组织工程研究中,种子细胞、生长因子以及组织工程支架是三大要素.理想的种子细胞应具备:取材容易,对机体损伤小,体外培养时增殖力强、易稳定表达软骨细胞表型,植入体内后能耐受机体免疫,且无致瘤性等特点.间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)不仅具有以上优点,还具有自我复制、多向分化、抗炎作用和营养作用等特性.因此,MSCs是软骨组织工程中理想的种子细胞.研究MSCs在软骨组织工程中的应用有着重要的意义.
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干细胞在软骨组织工程中的研究现状及进展
干细胞( stem cells,SCs)是一类未充分分化的、具有自我复制能力的多潜能细胞,因其具有在一定条件下可以再生人体各种组织器官的潜在功能,被在肿瘤、遗传性疾病和组织器官损伤的治疗等方面寄予厚望.由创伤或非创伤性病理损害如类风湿性关节炎等所造成的关节软骨缺损在临床上十分常见,由于关节软骨的修复能力有限,软骨缺损的治疗存在巨大挑战.而胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)和间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有自我更新和多功能分化潜能的特性,在适当培养条件下可被诱导分化成软骨组织,这将为软骨疾病的治疗提供大量的健康备用组织,具有广阔的应用前景.
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软骨组织工程种子细胞源的研究进展
多种原因造成的关节软骨病变比较常见,软骨损伤后缺乏自愈能力,软骨缺损的修复一直是临床的难题.随着细胞生物学和材料科学的迅速发展,应用组织工程学技术修复软骨病损已成为可能,而优化种子细胞源是应用这一技术的前提和关键[1].
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软骨组织工程强化技术的应用研究
软骨是应用组织工程技术早构建的组织,其中具代表性的研究是:1991年Vacanti等[1]用分离的牛关节软骨细胞与可降解的生物材料在裸鼠皮下成功构建出成熟的透明软骨组织.研究组织工程化软骨较多的原因是:软骨组成单一,结构简单,基质中包含软骨细胞这一种细胞,无血管及神经等复杂结构,在构建过程中影响少,便于研究;其次是软骨由于缺少血运,临床上患者软骨缺损后难以自身修复,移植软骨细胞、移植骨与软骨组织等治疗方法虽取得较满意的近期效果,但远期结果组织易塌陷、退变加快,且自体供区取材后较多并发症.因此组织工程化软骨的构建成功不仅有重要的理论创新价值,还具有明显的临床应用前景[2].软骨组织工程至少包括三个方面的研究内容:种子细胞的获取与扩增、分化增殖;生物材料的选择与构建;合适的修复环境及细胞因子的作用.
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藻酸钙的特性及在软骨组织工程的应用
软骨缺乏血运,仅靠关节滑液提供大部分营养,因此软骨组织的自身修复能力极其有限,一旦损伤难以修复,继发的创伤性关节炎、关节退行性变、关节僵直将会导致严重的功能障碍.
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软骨组织工程中的细胞来源及其影响因素
关节软骨在受到创伤或退变后,不能自我修复.传统的治疗方法不能取得满意的效果,运用组织工程方法修复关节软骨缺损展示了令人鼓舞的前景.如何选择和改良种子细胞是构建组织工程软骨的关键,本文就该领域的进展作一综述.
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软骨细胞外基质对脐带Wharton胶间充质干细胞生物学性状的作用
[目的]探讨软骨细胞外基质微环境对源于人脐带Wharton胶的间充质干细胞增殖的影响,观察该微环境促进干细胞向软骨细胞方向分化的潜能.[方法]①取3％ (w/v)猪关节软骨细胞外基质和2.4％ (w/v)海藻酸盐为原料,按体积比1∶1的比例充分混合,将其用带16G针头的1 ml注射器匀速滴入氯化钙溶液制作软骨细胞外基质/海藻酸盐混合凝胶微球,通过扫描电镜观察该微球内部结构.②将人脐带Wharton胶中间质干细胞(WJMSCs)混于软骨细胞外基质/海藻酸混合液,滴入氯化钙溶液形成复合干细胞的混合凝胶微球进行培养,设为实验组；同理WJMSCs混合于单纯藻酸盐凝胶并形成微球作为对照组.③通过扫描电镜和FDA-PI染色观察上述两组微球内细胞的生长粘附情况,体外培养4周,经组织学和DNA测定观察干细胞的表型及增殖情况.[结果]①构建的软骨细胞外基质/海藻酸盐混合凝胶微球呈半透明乳白色,内部具有较多不规则的孔隙结构,具有三维立体培养细胞的环境特点.②比较实验组和对照组不同细胞培养时间段细胞增殖量,发现实验组细胞增殖率高于对照组,第28 d时两组细胞DNA含量的差异有统计学意义,(P＜0.05).③实验组中细胞呈圆形或椭圆形,形成明显的软骨陷窝样的结构,有大量细胞外基质分泌,对照组中细胞呈圆形,陷窝样的结构不明显.④组织学染色观察发现:实验组中培养的干细胞明显有向软骨细胞方向分化的趋势.[结论]软骨细胞外基质微环境不仅利于人脐带Wharton胶中间质干细胞的增殖,而且具有将WJMSCs向软骨细胞方向诱导分化的潜能.
关键词： 脐带Wharton胶间充质干细胞 软骨细胞外基质 藻酸盐 软骨组织工程 -
TGF-β3真核表达载体转染骨髓基质干细胞促进其向软骨分化的实验研究
[目的]构建生长转化因子(TGF-β3)含绿色加强绿色荧光蛋白的真核表达质粒pIRES2-EGFP-TGF-β3,然后用该质粒转染骨髓基质干细胞(Marrow stromal cells,MSCs)并促进MSCs向软骨方向分化.[方法]用RT-PCR法从大鼠的胚胎组织中提取TGF-β3的DNA全长,首先连接到pMDl8-T载体,扩增、纯化后经测序公司测序确定插入目的基因序列的正确性,然后再用带有EcoRI、PstI内切酶的引物,从pMD18-T将TGF-β3的全长再次扩增出来,后将带有酶切位点的TGF-β3的全长插入到真核质粒pIRES2-EGFP中,构建真核表达载体pIRES2-EGFP-TGF-β3.体外培养大鼠MSCs,应用阳性脂质体将pIRES2-EGFP-TGF-β3转染到MSCs中,24 h后在荧光显微镜下观察蛋白的表达,流式检测MSCs的转染效率;Westen Blot检测TGF-β3蛋白的表达;之后进行MSCs细胞球团培养,分别于第7、14、21、28 d检测软骨基质胶原Ⅱ,胶原Ⅹ和Aggrecan的表达,同时用甲苯胺蓝检测蛋白聚糖(proteoglycan)的表达.[结果]测序结果和酶切鉴定结果表明成功的构建了pIRES2-EGFP-TGF-β3质粒,转染MSCs之后,转染的效率达30%.Westen Blot结果表明TGF-β3获得了成功的表达,在接下来的细胞球团培养过程中,转染后MSCs被成功诱导向软骨分化.
