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丙型肝炎病毒Core与NS3基因的不同融合方式及其表达
丙型肝炎病毒(简称HCV)是危害人类健康的传染性疾病,预防该病的传播主要借助于HCV血清学诊断来筛选献血员和检测临床标本.从国内外已分离到的HCV株得知,HCV核心蛋白(Core)和非结构蛋白NS3含有较强的优势抗原表位,其相应的抗体出现早,阳性率高,已成为目前第二、第三代HCV免疫诊断试剂的重要成份[1,2].通常Core蛋白和NS3蛋白分别用基因工程方法表达,然后作为固定化抗原,检测人体内HCV的抗体.我们对Core和NS3的两种不同组合方式及其表达的研究,对于发展新的HCV诊断试剂很有帮助,现将结果报道如下.
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融合基因ETV6-NTRK3在恶性血液病中的表达及临床意义
目的:研究融合基因ETV6-NTRK3在血液系统恶性肿瘤中的表达水平及其特点,并寻找其与免疫表型之间的关系,初步探讨该融合基因在临床诊断、治疗及预后判断等方面的价值.方法:收集未治疗的血液系统恶性肿瘤患者的骨髓液共47例及其中14例经标准化疗方案化疗2个疗程的急性髓细胞白血病(AML-M2)患者的骨髓液,釆用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增特定的融合基因片段.同时,对47例初治患者使用流式细胞术进行FCM免疫表型分析.结果:47例血液系统恶性肿瘤中,有2例表达ETV6-NTRK3融合基因,均为AML-M2a患者,其在M2中阳性率约为14%(2/14).未能查到NTRK3-ETV6和NTRK3基因.结论:①约有14%AML-M2患者存在ETV6-NTRK3融合基因t(12;15)(p12;q25).均为M2a,为老龄患者,且伴有骨髓纤维化;②目前的标准化疗方案,对表达ETV6-NTRK3融合基因患者效果不佳,为难治性白血病,患者预后不良;③FCM免疫表型分析结果表明,表达ETV6-NTRK3融合基因的为AML M2型,表达CD13和CD33,且CD13表达强于CD33,不表达CD14,白血病细胞起源早,分化程度差,恶性度高.
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Xp11.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌3例临床病理分析
目的:探讨Xp11.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌的临床病理特征.方法:回顾性分析2012～2013年间收治的3例Xp11.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌患者的临床病理及免疫组织化学标记资料:女2例,男1例,年龄23～36岁,平均29.3岁.肿块直径4～8 cm.均行肾癌根治术,术后行病理及免疫组织化学检查.结果:光镜下见癌组织呈实性片状、乳头状分布,肿瘤细胞较大,边界清楚,胞质有嗜酸性细颗粒状,细胞核呈空泡状,核仁明显.3例免疫组织化学检查TFE3表达均呈阳性.结论:Xp11.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌是一种少见肿瘤,诊断主要依据患者年龄、组织学形态和免疫组织化学TFE3阳性表达来确诊.
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同种肝移植大鼠转染融合基因人CTLA4-Ig抑制急性排斥反应
目的观察同种肝移植大鼠转染融合基因人CTLA4-Ig(huCTLA4-Ig)对急性排斥反应的抑制作用.方法供者为BN大鼠,受者为Lew大鼠.将受者分为三组,A组(5只):为空白对照组,供肝冷保存时不感染腺病毒;B组(4只):为阴性对照组,供肝冷保存时感染携带报告基因GFP的重组腺病毒;C组(5只):为基因治疗组,供肝冷保存时,先体外后体内感染携带融合基因huCT-LA4-Ig的重组腺病毒;观察该治疗基因在受者体内的表达及其对急性排斥反应的抑制作用.结果(1)A组与B组受者均在3周内死亡,A、B组平均生存时间分别为(16.6±2.5)d和(15.5±3.1)d,C组受者均能获得长期生存(＞150 d);C组与A、B组生存期比较,差异有统计学意义(P＜0.01).(2)移植肝病理学检查发现:术后8 d,A组与B组移植肝均发生严重的细胞性排斥.C组术后8 d,可见移植肝轻、中度的汇管区炎症,但组织损伤程度显著减轻;术后150 d,可发现单核细胞浸润,但胆管保存完好,无血管损伤证据.(3)术前大鼠血清白细胞介素2(IL-2)浓度为(362.09±45.84)ng/L;肝移植术后,A、B组血清IL-2的浓度即升到较高水平(约为术前的1.5～2.5倍),而C组却始终维持在一个较低水平(接近或低于术前水平);术后3、7 d,C组血清IL-2的浓度与A、B组比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论建立了简便有效的针对血管化移植物的基因转移系统;系统中重组腺病毒在冷保存时能有效感染供肝,并获得融合基因的分泌性表达.移植肝局部产生的可溶性融合蛋白huCTLA4-Ig,能抑制同种急性排斥反应,在不使用常规免疫抑制剂情况下,获得大鼠同种异体移植肝的长期存活.
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重组超抗原SEB-scFv融合蛋白的体内抑瘤作用
以单克隆抗体(mAb)作为载体的宫颈癌靶向治疗目前取得了一定的进展,但是多次使用会产生人抗鼠抗体反应(HAMA),限制其临床应用,同时完整抗体分子量大、穿透能力差、血液清除率慢致使肿瘤/血比值低,为克服mAb的上述缺点,我们在克隆出抗宫颈癌单克隆抗体轻、重链可变区基因的基础上,利用重组聚合酶链反应反应(PCR)方法制备抗宫颈癌单链抗体(ScFv),并将其与金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因融合,构建表达出融合蛋白SEB-scFv,注射到宫颈癌动物模型体内,进行抑瘤作用的初步研究.
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荧光原位杂交检测早期前列腺癌中TMPRSS2与ETS基因融合
目的 应用荧光原位杂交(FISH)技术检测前列腺组织中TMPRSS2基因与ETS家族基因ERG、ETV1、ETV4之间融合的表达,探讨其诊断早期前列腺癌的可行性.方法 前列腺癌36例,平均年龄73.6岁,为实验组;前列腺增生患者20例,年龄平均69.1岁,为对照组.采用随机法合成TMPRSS2与ERG、ETV1、ETV4融合基因FISH探针.分析融合基因与前列腺癌组织生物学特性中Gleason评分、血清前列腺特异性抗原(PSA)、临床分期(pT)、淋巴结转移及根治性前列腺癌后切缘情况阳性与否之间关系.结果 FISH总的敏感性为80.6％ (29/36),其中ERG探针为52.8％(19/36),ETV1为22.2％(8/36),ETV4为5.6％(2/36),特异性为100.0％.FISH探针阳性组和阴性组与前列腺癌的Gleason评分、血清PSA水平之间差异有统计学意义(P＜0.05);与pT、淋巴结转移以及根治性前列腺癌后切缘情况阳性与否差异无统计学意义(P＞0.05).结论 FISH探针检测列腺癌组织中的TMPRSS2-ERG、ETV1及ETV4融合基因,敏感性较高、特异性强.
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儿童Xp11.2易位/TFE3基因融合相关肾细胞癌
目的 研究儿童Xp11.2易位/TFE3基因融合相关肾细胞癌的生物特性,提高对该病的认识.方法 回顾性分析1973年1月至2013年6月收治的33例儿童肾细胞癌的临床病理资料,其中24例确诊为Xp11.2易位/TFE3基因融合相关肾细胞癌,总结其临床表现、分期、病理分型、治疗及随访结果.结果 本组24例中,男13例,女11例;年龄2.5～16岁,平均10.2岁;左侧肾细胞癌13例,右侧11例.无痛肉眼血尿19例(1例为外伤后血尿),血尿+腹部包块2例,腹部包块1例,血尿+腹痛1例,行B型超声检查偶然发现1例.24例患儿中,4例肿瘤直径＜7.0 cm,行保留肾单位的肿瘤剜除术;1例因肿瘤直径15.0 cm包绕腹主动脉和下腔静脉,仅行肿瘤大部分切除;1例肿瘤巨大,直径25.0 cm,术中有肉眼残留.余18例患儿均行瘤肾切除术.肿瘤直径2.5～25.0 cm,平均7.2cm.Ⅰ期11例,Ⅲ期11例,Ⅳ期2例.17例获随访,随访时间6个月～35年,平均12年,死亡2例,无瘤存活15例.结论 Xp11.2易位相关肾癌是儿童肾细胞癌的主要病理类型,缺乏特异性的临床表现和影像学特点,易发生局部淋巴结转移,分期高,但在儿童表现为生物活性惰性.手术切除是主要的治疗方法,肿瘤直径小于7.0cm可行保留肾单位的肿瘤剜除术.
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利用实时反向转录PCR的分子定量监测TEL-AML1+儿童急性淋巴细胞性白血病的治疗反应和缓解状况
运用分子生物学技术及流式细胞术,对治疗反应和微小残留白血病病灶(MRD)进行灵敏的定量分析,可以更加可靠地预测儿童急性淋巴细胞性白血病(ALL)患者的预后及复发风险 .分子水平的研究大多数利用T细胞受体(TCR)和免疫球蛋白基因重排作为唯一克隆特异性标志来监测MRD,但这种DNA水平上的研究方法时间长、费用高而且工作量大.在儿童ALL 中,有35%～45%出现染色体易位,形成融合基因,出现嵌合体转录本以及表达相应的蛋白质 .儿童初发前B细胞-急性淋巴细胞性白血病(BCP-ALL)常见的基因重排是隐性易位t(1 2;21)(p13;q22),可导致21号染色体上的AML1序列与12号染色体的TEL基因融合.TEL和AM L1这两种转录因子均为正常造血所必需,而且它们的基因部位分别与急性或慢性白血病及骨髓增生异常综合征相关的染色体易位有关.
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Xp11.2易位/TFE-3基因融合相关性肾癌1例并文献复习
0 引言Xp11.2易位/TFE-3基因融合相关性肾癌(renal carcinoma associated with Xp1 1.2 translocations/TFE-3 gene fusions)在2004年WHO分类里首次被归为一个亚型[1],各个年龄段(2～79岁)均可发生,但主要见于儿童和年轻人,约占此类人群中肾癌比例的1/3[2],而在中老年肾癌患者中仅占1.6％ (4/244)[3].近来研究发现,Xp11.2易位/TFE-3基因融合相关性肾癌在青幼年患者中临床生物学行为与中老年人相比,可能有明显不同[4-51.由于该肿瘤比较少见,现对我院确诊的一病例进行复习,以加深对其认识.
关键词： Xp11.2/TFE-3 易位 基因融合 肾癌 -
突变APP荧光融合基因的构建和表达
目的 探讨阿尔茨海默病(Alzheimer disease)的发病机制,研究淀粉样蛋白前体(amyloid protein precursor,APP)酶解过程,构建含有APP Flemish突变的荧光真核表达系统.方法 通过聚合酶链式反应(PCR)得到含有Flemish突变的APP后300 bp片段(C99)、黄色荧光蛋白碱基序列(yellow fluorescence protein,YFP),利用基因工程技术将YFP、C99片段克隆至载体质粒pcDNA3.0中,通过酶切,测序鉴定终得到重组质粒pcDNA3.0-YFP-C99,将其转染至人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)中,利用激光共聚焦显微镜观察融合基因表达和Ap的生成,MTT检测转染细胞活性.结果 ①基因序列分析证明重组质粒构建成功;②激光共聚焦显微镜下观察黄色荧光分布于转染细胞内,表明融合基因能够准确表达荧光;③MTT检测显示Ap生成后细胞活性下降,差异有极显著性意义(P%0.01);④激光共聚焦显微镜下观察YFP-C99能够生成A8,转染细胞内有荧光颗粒聚集沉积,形态异常.结论 荧光标记APP Flemish突变重组质粒构建成功,为进一步在体研究APP的有序裂解特别是γ裂解活动奠定了基础.
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ALK阳性非小细胞肺癌的细胞异质性的技术因素分析——非生物学解释
2007年在肺腺癌一个小亚群中发现的间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)基因重排界定了一类新的非小细胞肺癌(non-small-cell carcinoma,NSCLC)分子亚型[1].这些ALK-重排的肿瘤中腺癌常见,经常可见印戒黏液细胞,无表皮生长因子受体(EGFR)或结直肠癌基因——KRAS突变,更多出现于不吸烟或轻度吸烟患者中,但一些ALK-重排的NSCLC不符合以上描述.目前已确定多种基因融合变异;常见的为2号染色体短臂发生倒位形成的EML4-ALK基因融合.
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浅析急性早幼粒细胞白血病诊断及治疗
急性早幼粒细胞白血病发病急,骨髓与外周血中主要的细胞是原始细胞,这种病不及时治疗的话,很可能危及生命.这种病的的病因目前尚不明确.急性早幼粒细胞白血病(简称APL),是急性髓细胞白血病常见的表现,患者有明显的出血现象,偶而还有血栓凝结而引起的突然失明等表现.继发的患者经常应用化疗或放疗.继发性的APL的患者预后是较好的,其对治疗的反应和长期生存率与原发者相近.APL是急性白血病的一个独特类型,以t染色体易位为表现的特征,大约95%的患者都发生这种染色体的易位.T染色体易位产生一种由位于17号染色体与位于15号染色体的早幼粒细胞性白血病基因融合而成的合成基因,该基因转录后表达的产物是蛋白质,可使幼粒系分化阻滞在初期阶段,从而导致骨髓中的异常早幼粒细胞的增殖,终导致APL病灶的发生.因此导致APL发生的分子基础是融合基因.本文主要通过对APL的发病机制的分析,确定其诊断与治疗.
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问号赖型钩端螺旋体内鞭毛与外膜基因融合DNA疫苗载体的构建
目的:为增强问号赖型钩端螺旋体(017株钩体)内鞭毛抗原(flaB)与外膜抗原(ompL1)的免疫保护作用,克服保护性免疫持续时间短的难题,应用DNA重组技术以pcDNA 3.1为载体构建-表达flaB与ompL1基因的融合DNA疫苗载体,以期注入肌体后能延长保护期,激发机体长期免疫.在pcDNA3.1载体上,ompL1与flaB前后相连,前者较后者先获得递呈,与钩体天然递呈过程相似,并且双嵌合基因可诱导机体产生针对2个不同抗原表位的抗体,从而增加免疫应答能力.pcDNA3.1载体能表达融合蛋白,并且具有CpG motifs,因而可发挥佐剂作用.方法:提取017株钩体基因组DNA,参照钩体特有的高度保守的flaB与ompL1序列,设计二对四条引物:P1、P2、P3、P4.flaB与ompL1已被证实是两个良好的钩体疫苗候选抗原.通过聚合酶链反应(PCR),P1、P2引物扩增017株钩体的ompL1抗原基因;P3、P4引物扩增钩体的flaB抗原基因,分别经双酶切,以pcDNA3.1载体,将ompL1与flaB顺次同时定向嵌入同一pcDNA3.1中,获得重组质粒(ompL1与flaB),并将其转入JM109宿主菌中.在设计引物时,分别在P2、P3引物中,采用多个结构简单又不易形成折叠的甘氨酸作为接头,以维持其空间构象,不影响自然折叠,保持天然活性.结果:经酶切鉴定证实:有一1.8 kb片段插入载体,进一步经酶切证实这一1.8 kb可被酶切为9.6 kb及8.5 kb的片段,与预期的片段大小一致.以嵌合重组质粒DNA为模板,经PCR证实:P1、P2引物扩增出9.6 kb片段;P3,P4引物扩增出一8.5 kb片段.重组质粒经DNA序列检测,其中ompL1与flaB序列与文献报道的完全一致.结论:表达017钩体flaB与ompL1抗原的融合蛋白的DNA疫苗载体构建成功,从而为下一步表达复合功能蛋白,进行钩体免疫保护性研究打下了基础.
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容故纳新,靶向新星:NTRK1融合
2013年10月,Vaishnavi等[1]在《Nat Med》上首次报道了肺癌患者的融合基因NTRK1.他们对36例肺腺癌患者进行基因检测,这些患者通过标准的临床检测方法均没有发现常见的已知基因突变包括EGFR、ALK基因.然后对肿瘤组织标本进行了二代测序检测,发现其中有2例患者存在NTRK1激酶区基因融合.NTRK1激酶区是编码高亲和力神经生子因子受体(TRKA蛋白)的基因.在他们的研究中发现了两种新融合型,即肌球蛋白磷酸酶结合蛋白MPRIP?NTRK1融合和CD74?NTRK1融合.MPRIP涉及肌动蛋白细胞骨架的调节,而CD74基因是编码主要组织相容性复合体Ⅱ级恒定链,与ROS1基因发生融合.该研究还利用FISH的方法再次证实了这两种染色体融合.同时这两种基因型在体外实验中被证实可以使TRKA蛋白发生自磷酸化从而激活其致瘤作用.在体外模型中,具有抗TKRA活性的酪氨酸激酶抑制剂ARRY?470、Lestaurtinib(CEP?701)和克唑替尼可以使细胞周期停滞,抑制细胞增殖.
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CDglyTK双自杀基因杀伤C6胶质瘤细胞的体外实验研究
目的观察CDglyTK双自杀基因对C6胶质瘤细胞的杀伤作用及旁观者效应.方法利用逆转录病毒介导的胞嘧啶脱氨酶(CD)、单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)融合基因转染C6胶质瘤细胞,通过细胞集落形成试验、细胞生长抑制率(GIR)测定(MTT法),检测和分析CD/5-氟胞嘧啶(5-FC)、HSV-tk/更昔洛韦(GCV)双自杀基因系统对肿瘤细胞的杀伤作用和旁观者效应. 结果RT-PCR检测分析融合基因的表达,显示逆转录病毒介导的双自杀基因在C6胶质瘤细胞中表达.不加5-FC和GCV时,转染组和对照组肿瘤细胞集落形成和倍增时间分别为94 h、96 h和25.7 h、26.6 h,组间差异比较无显著意义(P＞0.05).在5-FC(80.0mg/L)和GCV(10-1mg/L)浓度下,GIR分别为83.36%、7.08%,差异比较有显著意义(P＜0.01).转染C6胶质瘤细胞在混育细胞中比例占5%时,即可获得明显的旁观者效应,细胞生长抑制率可达38.48%.结论CDglyTK融合基因联合双前药治疗能取得显著的抗胶质瘤作用.
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鼠抗人纤维蛋白单链抗体-低相对分子质量单链尿激酶融合基因真核分泌表达载体的构建
目的构建鼠抗人纤维蛋白单链抗体-低相对单链尿激酶融合基因真核分泌表达载体。方法应用重组DNA技术,将人工合成的尿激酶原信号肽基因与鼠抗人纤维蛋白单链抗体-低相对分子质量单链尿激酶融合基因连接,并保证在同一阅读框架,然后分别插入到pcDNA3和PMJK3两种真核表达载体中。结果构建成可以在真核细胞中分泌表达鼠抗人纤维蛋白单链抗体-低相对分子质量单链尿激酶融合蛋白的重组质粒pcDNA3-D1和pMJK3-D1。结论为建立稳定分泌表达鼠抗人纤维蛋白单链抗体-低相对分子质量单链尿激酶融合蛋白的细胞工程株奠定了基础。
关键词： 单链抗体 低相对分子质量单链尿激酶 基因融合 -
人肝细胞生长因子与肝再生增强因子融合基因真核表达质粒的构建及鉴定
目的:构建人肝细胞生长因子(hHGF)与肝再生增强因子(hALR)融合基因的真核表达质粒并进行鉴定,为促肝细胞再生研究奠定实验基础.方法:首先分别以重组质粒pUC18-hHGF和Puc18-hALR为模板,进行PCR扩增,获得hHGF和hALR的基因序列,然后利用重叠延伸PCR方法将获得的基因序列通过一个连接序列进行连接,构建融合基因hHGF/hALR.后将融合基因定向插入到真核表达质粒pcDNA3.1的Nhe I和Xba I酶切住点之间,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-hHGF/hALR,并进行双酶切及测序鉴定.结果:hHGF和hALR的PCR扩增产物电泳后分别观察到2.2 kb和0.4kb的单一DNA条带,与理论值相符.重叠延伸PCR扩增后的融合基因产物电泳后观察到2.6kb的单一DNA条带,与预期值一致.重组真核表达质粒pcDNA3.1-hHGF/hALR经双酶切,电泳后观察到2.6 kb和5.4kb的两条DNA条带,与预期值相符,测序鉴定结果表明序列正确.结论:成功构建了hHGF与hALR融合基因的真核表达质粒,为促肝细胞再生研究奠定实验基础.
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急性淋巴细胞白血病常见融合基因检测及临床研究进展
白血病是儿童常见的恶性肿瘤,其中急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)约占80%左右,儿童中发病率达到0.3～0.4/万.研究发现,细胞遗传学改变在白血病发生发展过程中起着重要作用.常见的细胞遗传学异常如染色体数目改变、染色体易位和原癌基因异常表达等通过改变造血细胞的自我更新、增殖和分化机制导致造血干细胞或定向祖细胞向白血病细胞转化.
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人IL-12基因与糖基化磷脂酰肌醇信号肽序列融合基因真核双表达质粒的构建及表达
基因987 bp和P35基因762 bp,合成hPLAP-1 C末端信号肽序列117 bp,并将GPI信号肽序列与P40基因成功拼接,成功构建了真核表达载体pBudCE4.1/IL-12A/IL-12B-GPI(命名为pBIG),经酶切及测序鉴定正确.激光共聚焦显微镜观察带锚定蛋白的IL-12在肾癌细胞膜上高表达,并能被磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C洗脱.结论 真核双表达载体pBIG的构建及表达,为进一步制备肾癌疫苗奠定了基础.
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小鼠精子Sp17与IL-5融合蛋白的构建、表达及其免疫原性鉴定
目的 构建和表达小鼠精子蛋白Sp17与白介素5(IL-5)融合蛋白,并对其进行纯化和免疫原性鉴定.方法 采用PCR技术从质粒pGEM-1-IL-5中扩增IL-5基因片段,将其克隆至pET/Sp17原核表达载体中与Sp17基因融合,构建重组质粒pET/Sp17-IL-5,经酶切鉴定后转化大肠杆菌B121(DE3),IPTG诱导表达,采用Ni2+-NTA Agarose 纯化,SDS-PAGE检测、N端测序及Western blot;重组蛋白Sp17.IL-5免疫小鼠后ELISA检测小鼠血清特异性抗体.结果 成功构建小鼠精子蛋白Sp17与IL-5融合蛋白的高效表达质粒pET/Sp17-IL-5,重组工程菌pET-28a(+)-sp17-IL-5/BL21经IPTG诱导目的蛋白表达率约28%,PAGE初步测定目的蛋白相对分子量(Mr)约39 000,纯化后蛋白纯度达91%,免疫后小鼠血清中检测到特异性抗体.结论 Sp17-IL-5蛋白经基因克隆获得了较高的表达量,并初步显示了较好的免疫活性,为新型Sp17避孕疫苗的研制奠定基础.
