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带J链的α-防御素-1基因转染COS-7细胞后的表达检测
目的将α-防御素-1(HNP-1)基因与J链基因重组为一种新的杀菌肽分子JHNP-1,观察J-HNP-1在细胞内的表达及分泌情况.方法采用聚合酶链反应(PCR)方法分别从pCH-J质粒和pBabeNeo-HNP-1质粒中扩增出J链和HNP-1;进行重组PCR,获取 J-HNP-1 DNA 片段,并插入哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1(-)/Myc-HisC中;用脂质体转染法将此重组真核表达载体导入COS-7细胞,然后应用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测Histag 标签基因.结果用抗His抗体检测到细胞可溶性蛋白及培养上清在约24 ku处均有强反应条带显示,其大小与预测相符;对照组未见相应条带显示.结论采用Western blot检测到新的杀菌肽分子J-HNP1在细胞内得到表达并分泌到细胞外,为进一步研究J-HNP1杀菌肽的抗菌活性奠定了基础.
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用重组PCR技术缺失突变人单核细胞趋化蛋白-1基因
目的:用重组PCR技术对人单核细胞趋化蛋白-1(hμMCP-1)基因cDNA进行缺失突变,构建其突变体-7 ND cDNA.方法:根据hμMCP-1基因缺失突变前后的两段基因分别设计两对含有酶切位点的引物,以pBlueScript-hμMCP-1为模板,进行重组PCR反应,将PCR产物与T载体连接进行TA克隆,酶切鉴定并测序确定其长度为342 bp,继之将目的基因克隆入pcDNA3.1真核表达载体.结果:成功构建hμMCP-1cDNA突变体-7ND的真核细胞表达载体,测序结果表明,该突变体N端第2至8位氨基酸缺失.结论:重组PCR技术是十分有效、可靠的基因缺失突变方法.
关键词： 单核细胞化学吸引蛋白质1 基因缺失 克隆 分子 重组聚合酶链反应 -
重组超抗原SEB-scFv融合蛋白的体内抑瘤作用
以单克隆抗体(mAb)作为载体的宫颈癌靶向治疗目前取得了一定的进展,但是多次使用会产生人抗鼠抗体反应(HAMA),限制其临床应用,同时完整抗体分子量大、穿透能力差、血液清除率慢致使肿瘤/血比值低,为克服mAb的上述缺点,我们在克隆出抗宫颈癌单克隆抗体轻、重链可变区基因的基础上,利用重组聚合酶链反应反应(PCR)方法制备抗宫颈癌单链抗体(ScFv),并将其与金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因融合,构建表达出融合蛋白SEB-scFv,注射到宫颈癌动物模型体内,进行抑瘤作用的初步研究.
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PCR介导嗜肺军团菌疫苗候选基因lvgA和Hsp60的融合及其在大肠杆菌中表达的初步研究
目的采用PCR法进行嗜肺军团菌lvgA和Hsp60二基因的拼接融合,克隆并检测该融合基因在原核系统中表达情况,为进一步研究其免疫性能作必要的准备.方法采用重组聚合酶链反应,设计引物首先分别从嗜肺军团菌基因组DNA中扩得待融合端互补的军团菌毒力基因(lvgA)和热休克蛋白60基因(Hsp60),经琼脂糖电泳纯化回收,再以适量lvgA和Hsp60为模板变性、退火、重叠延伸,实现二基因的PCR水平融合,随后采用外引物进行新一轮扩增,扩得足量lvgA/Hsp60融合基因的PCR产物,继而将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒,转化宿主菌BL21,经PCR、酶切及测序鉴定后,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析等鉴定.结果扩增出了约2292bp的lvgA/Hsp60融合基因,构建了原核表达重组质粒pGlvgA/Hsp60,并检测到Mr约117000的GST-lvgA-Hsp60融合蛋白表达条带.结论采用PCR法实现了嗜肺军团菌lvgA和Hsp60二基因的融合,构建了其原核表达重组质粒,并使该融合蛋白在原核系统中得到了有效的表达,为进一步研究该融合基因的免疫学特性奠定了基础.
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重组聚合酶链反应扩增乙型肝炎病毒跨直接重复序列区DNA片段方法的建立
目的 建立使用重组聚合酶链反应(PCR)扩增乙型肝炎病毒(HBV)跨直接重复序列(DR)区DNA片段的方法.方法 使用Primer5引物设计软件,以黏性末端为基础设计引物,HBV“大三阳”乙型肝炎表面抗原(+)、乙型肝炎核心抗体(+)、乙型肝炎e抗原HBeAg(+)]血清提取DNA为PCR模板,第1轮PCR分段扩增,第2轮PCR以粘性末端为引物两端补齐,第3轮PCR扩增整段HBV跨DR区DNA片段.结果 成功重组出HBV跨DR区缺口的DNA片段.结论 建立了HBV跨DR区DNA片段的扩增方法,为该段DNA片段功能的研究打下了基础.
