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三种致病耶尔森氏菌Hsp60基因序列的比较研究
目的研究3种致病耶尔森氏菌Hsp60基因序列的差异.方法根据文献和基因库中的Hsp60基因序列设计了两对PCR引物,获得Hsp60基因的部分序列.将扩增产物纯化回收,克隆至pGEM-T载体后进行测序.结果用CLUSTAL X软件进行序列分析,发现3种耶尔森氏致病菌的Hsp60基因序列较为保守,其中鼠疫耶尔森氏菌和假结核耶尔森氏菌的该基因序列在所研究范围内仅相差一个碱基.结论 3种菌的Hsp60基因保守,不足以在此区间设计种特异性探针.小肠结肠炎耶尔森氏菌与鼠疫耶尔森氏菌和假结核耶尔森氏菌的Hsp60基因序列差异较大,易与这两个种区分开.
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PCR介导嗜肺军团菌疫苗候选基因lvgA和Hsp60的融合及其在大肠杆菌中表达的初步研究
目的采用PCR法进行嗜肺军团菌lvgA和Hsp60二基因的拼接融合,克隆并检测该融合基因在原核系统中表达情况,为进一步研究其免疫性能作必要的准备.方法采用重组聚合酶链反应,设计引物首先分别从嗜肺军团菌基因组DNA中扩得待融合端互补的军团菌毒力基因(lvgA)和热休克蛋白60基因(Hsp60),经琼脂糖电泳纯化回收,再以适量lvgA和Hsp60为模板变性、退火、重叠延伸,实现二基因的PCR水平融合,随后采用外引物进行新一轮扩增,扩得足量lvgA/Hsp60融合基因的PCR产物,继而将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒,转化宿主菌BL21,经PCR、酶切及测序鉴定后,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析等鉴定.结果扩增出了约2292bp的lvgA/Hsp60融合基因,构建了原核表达重组质粒pGlvgA/Hsp60,并检测到Mr约117000的GST-lvgA-Hsp60融合蛋白表达条带.结论采用PCR法实现了嗜肺军团菌lvgA和Hsp60二基因的融合,构建了其原核表达重组质粒,并使该融合蛋白在原核系统中得到了有效的表达,为进一步研究该融合基因的免疫学特性奠定了基础.
