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传染性法氏囊病病毒 VP2/4/3-ChIL-2融合基因DNA疫苗免疫原性研究
应用重叠延伸剪切技术(splicing by overlapping extension,SOE),经3次PCR将传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus, IBDV)多聚蛋白(VP2/4/3)基因和鸡白细胞介素2(Chicken IL-2, ChIL-2)基因进行融合,定向插入真核表达载体pCI的CMV启动子下游,获得重组质粒pCI-VP2/4/3-IL-2和pCI-IL-2-VP2/4/3.将其制备成DNA疫苗,肌肉注射14日龄非免疫鸡,2周后加强免疫,定期测定鸡抗IBDV血清ELISA抗体效价及病毒中和抗体效价.加强免疫后3周用IBDV标准强毒株攻击,连续观察3天后全部扑杀,计算保护率及囊体比,并进行组织病理学检查.结果表明:1)融合基因重组质粒pCI-VP2/4/3-IL-2、pCI-IL-2-VP2/4/3免疫后能明显增强IBDV DNA疫苗对强毒的攻击保护(保护率分别为83.3%、91.6%),显著高于pCI-VP2/4/3单独免疫对照组(58.3%);2)诱导产生的抗IBDV血清ELISA抗体效价明显增高(P＜0.05),同时能提高DNA疫苗诱导产生的中和抗体效价(P＜0.05);3)能显著促进鸡外周血液T淋巴细胞增殖反应.上述结果提示:IBDV VP2/4/3与ChIL-2基因融合后发挥了相互协同作用,ChIL-2产生了分子免疫佐剂效应;融合基因DNA疫苗能增强IBDV DNA疫苗的免疫原性,促进了机体特异性免疫应答.
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传染性法氏囊病病毒反向遗传技术发展及其应用
传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)是双股双节段RNA病毒科的主要代表,其主要侵害鸡的中枢免疫器官法氏囊,引起的传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是危害养禽业健康发展的重要免疫抑制病.IBDV反向遗传技术诞生的近20年来,病毒拯救技术不断完善,病毒基因功能研究更为深入,而且基于此的新型疫苗的研究也有较大进展.本实验室在该领域也做了比较系统和深入的工作.本综述对IBDV致病机制和防控研究具有重要启示意义.
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免疫刺激复合物(ISCOM)介导的传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因免疫的研究
将传染性法氏囊病病毒(IBDV)ZJ2000株的多聚蛋白(VP2/VP4/VP3)基因插入pCI质粒的CMV启动子下游,构建了真核表达质粒pCI-VP2/VP4/VP3,在Lipofectin介导下转染Vero细胞进行了多聚蛋白的瞬时表达.以免疫刺激复合物(ISCOM)为佐剂制备DNA疫苗,进行不同免疫剂量间、不同免疫途径间、一次免疫和二次免疫间的效果对比试验.结果表明:以肌内和皮内联合免疫法效果好,而口服和点眼等途径未能诱导足够的免疫反应;大于200μg的剂量DNA疫苗才能产生良好的免疫力;二次免疫的效果明显优于一次免疫.与常规的弱毒疫苗B87和D78相比,DNA疫苗产生中和抗体的潜伏期长、效价相对较低,对强毒攻击的保护率相当.本试验还证实,免疫刺激复合物具有明显提高DNA疫苗免疫效果的作用.DNA疫苗能诱导产生保护性反应,为今后IBD疫苗的研究开创了一条新的途径.
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表达传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因的重组马立克氏病病毒的构建
传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是一种由鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的危害3～12周龄青年鸡的急性、高度接触性传染病.IBDV属于双RNA病毒科的禽双RNA病毒属,其基因组由A和B两个节段组成.研究表明,IBDV主要的抗原性及致病性位点均位于A片段,其中VP2蛋白具有血清型特异性位点,并能诱导产生抗病毒的血清中和抗体,是该病毒的主要抗原[1～2].
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传染性法氏囊病病毒B87株 VP2基因克隆及序列分析
目的 获得传染性法氏囊病病毒(IBDV)B87株VP2基因,并对其序列进行分析. 方法 采用RT-PCR方法扩增传染性法氏囊病病毒B87株VP2基因,扩增产物提纯后克隆入pMD18-T载体,通过酶切、PCR和测序验证克隆,测序结果与GenBank下载的21株参考毒株VP2基因编码区全核苷酸序列进行比较. 结果 克隆的VP2基因序列长度为1 536 bp.所测B87株与Ⅰ型参考毒株的核苷酸同源性介于95.1%～99.2%之间,与Ⅱ型毒株的同源性仅为54.1%～54.7%. 结论 大多数IBDV强毒株、变异株、超强毒株与B87株的亲缘关系较远;诱导产生保护性中和抗体的VP2抗原决定簇的两个亲水区氨基酸变异较大,是逃避B87疫苗株的免疫保护、导致免疫失败而发生免疫鸡群传染性法氏囊病(IBD)流行的分子基础.
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传染性法氏囊病病毒疫苗株B87基因组A节段的克隆和序列分析
目的 获得传染性法氏囊病病毒疫苗株B87 A节段全长cDNA,并对其进行序列分析.方法 使用蛋白酶K、酚/氯仿抽提法提取病毒基因组,用LiCl分级沉淀方法纯化病毒基因组dsRNA,通过RT-PCR一步扩增获得A节段的全长cDNA.将其克隆至pGEM-T载体上,测序,并用DNAStar软件进行序列分析.结果 测序结果表明,克隆的B87株A节段全长为3 260 bp,与Gt株的同源性高为99.5%,与其他毒株的核苷酸同源性介于95.2%～99.4%之间,与Ⅱ型毒株OH仅为84.0%.结论 通过对20株IBDV编码氨基酸序列的分析、比较,推测A片段上7个独特的氨基酸位点可能与毒力相关.
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重组传染性法氏囊病病毒VP2/VP243基因表达及保护性和免疫原性
目的在重组鸡痘病毒中表达传染性法氏囊病毒VP2/VP243基因,并研究表达产物的保护性和免疫原性.方法以FPV282E4株TK基因为侧翼,分别将鸡法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)VP2和VP243目的基因克隆到牛痘病毒A型包涵体(ATI)和痘苗病毒P7.5复合型启动子下游,构建成2个重组表达质粒,命名为pUTALacVP和pUTALacVPO.用这2个质粒转染CEF细胞,用X-gal染色法筛选出2株重组病毒vUTAlacVP2和vUTALacVPO.用这2株病毒免疫1周龄SPF鸡,以常规疫苗为对照.结果 ELISA、SDS-PAGE和Western blot表明表达产物可与IBDV特异性多克隆抗体反应,并诱导鸡保护性抗体.在使用vvIBDV攻击前,对照组抗体水平显著高于实验组.但攻击5d后,实验组抗体水平明显升高.结论 vUTALacVP2和VPO在CEF细胞中实现了高效表达,但重组疫苗的保护率低于常规疫苗.
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传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP2比较及高表达毒株的分离
对29个传染性法氏囊病病毒(IBDV)的病理组织和毒株分别增殖后,采用不连续蔗糖密度梯度离心的方法纯化病毒,经SDS-PAGE分析,病毒结构蛋白VP2在不同毒株表达量有较大差异.对其中00ZB和99TA32个VP2相对高表达的IBD病理组织样品进行病毒分离,获得了2个IBDVVP2相对高表达毒株.
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法氏囊病病毒vp2基因在酵母中的分泌表达及鉴定
应用Pichia酵母表达系统高效分泌表达了传染性传染性法氏囊病病毒vp2基因片段.首先用Primer5.0设计1对引物P1、P2,以插入IBDV vp2基因的PMD18-T-VP2载体为模板,扩增出带有终止密码子的1.4kb片段,将此片段正向亚克隆到酵母表达载体pPICZα-A上,将构建好的重组载体pPICZα-A-VP2用Sac Ⅰ内切酶线性化后,电击转化整合入Pichia PastorisX-33酵母菌,经高浓度ZeocinTM筛选、表型鉴定、诱导表达及表达产物的鉴定,得到高效表达vp2基因的酵母工程菌X-33/pPICZα-A-VP2.工程菌72h培养上清的SDS-PAGE电泳与免疫印迹结果显示,vp2基因表达产物大小约为55 kDa,比预期的41kDa大.凝胶薄层扫描结合Bradford蛋白质总含量测定结果表明,表达产物占工程菌培养上清总蛋白的28%,表达量可达23 mg/L.间接ELISA结果表明重组表达产物能够有效地区分法氏囊病病毒标准阳性与阴性血清.
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传染性法氏囊病病毒不同分离株vp2基因部分核酸序列分析
根据已报告的传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)cDNA序列,设计引物,用RT-PCR扩增CH(鸡)、DU(鸭)、GE(鹅)和SP(麻雀)四种不同源IBDV分离株的vp2基因高变区.核酸序列测定分析表明,四种不同源IBDV分离株vp2基因高变区的同源性为97%,推导编码蛋白氨基酸序列的同源性98%,两个亲水区和七肽区的氨基酸序列完全一致.本研究结果提示,自然感染IBDV的鸭、鹅和麻雀不仅可成为病毒携带者或传染源,而且在病毒变异中起一定作用.
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鸡传染性法氏囊病病毒研究进展
传染性法氏囊病(Infection bursal disease, IBD)是由鸡传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)引起的鸡和火鸡的一种高度接触性传染病,给世界各国的禽养殖业带来了巨大损失.自IBDV发现至今新的变异株不断出现,分子结构的改变导致病毒致病力的改变及宿主对疫苗应答的改变,使得传统的疫苗已不能控制其流行,因此各国学者对其基因组结构和功能进行了广泛深入的研究,并积极研制新型有效的疫苗以达到防治的目的.
