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犬细小病毒VP2蛋白在家蚕/昆虫细胞中表达
目的 犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)能够引起犬急性出血性肠炎,在幼犬中的死亡率很高,为我国养犬业和经济动物养殖业带来巨大的经济损失.因而,寻找一种新型、安全、高效的疫苗为细小病毒性肠炎的防控具有重要意义.方法 本研究利用Bac-to-Bac表达系统构建了表达CPV VP2蛋白的重组杆状病毒rBV-D-VP2.该重组病毒感染昆虫细胞和家蚕后,表达CPV VP2蛋白.体外表达的VP2蛋白自动装配成病毒样粒子.随后用蚕蛹中大量组装成的病毒样粒子分别通过口服和肌注两种途径免疫豚鼠.结果 经电镜检测,观察到直径为25 nm大小的球形病毒样粒子,表明重组杆状病毒表达的VP2能形成病毒样粒子,且在大小、形态上与天然病毒相似.间接免疫荧光检测表明成功构建了表达VP2的病毒样粒子.口服和肌注两种途径免疫豚鼠,均产生了血凝抑制效价.结论 本研究为CPV新型亚单位疫苗的研究提供了依据.
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鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的原核表达与抗原性分析
目的表达鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)弱毒株VP2蛋白并检测其抗原活性.方法以IBDV强毒致弱株Gt株基因组RNA为模板,应用RT-PCR方法扩增VP2基因,并将其克隆入pUC18载体,经PCR、酶切及测序鉴定正确后,将其亚克隆到原核表达载体pET30a中,并经酶切、PCR、测序鉴定,阳性重组表达质粒转化E. coli BL21(DE3)菌,经IPTG诱导后,表达产物用SDS-PAGE及Western blot检测.结果阳性重组表达质粒转化E. coli BL21(DE3)后,经诱导表达了目的蛋白,表达量占菌体总蛋白的15%.Western blot检测表达蛋白可与IBDV阳性血清发生反应,而与阴性对照血清不发生反应.结论已成功表达了鸡传染性法氏囊病毒弱毒株VP2蛋白,且具有良好的抗原性.
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基于O型口蹄疫病毒VP21-33肽段增强VP1141-160肽段免疫原性的新型纳米颗粒疫苗研究
目的 研究O型口蹄疫病毒中VP21-33肽段能否增强VP1141-160肽段的免疫原性及其可能的免疫机制.方法 分别构建两种新的含有VP1和VP2的重组质粒(PcDNA3.1-VP1、PcDNA3.1-VP2),并将重组质粒制备成纳米颗粒,检测其体外转染效率.然后将上述纳米颗粒作为基因疫苗免疫Balb/c小鼠,PBS及空载质粒作为对照.液相阻断ELISA方法检测不同时间小鼠血清中抗体情况;流式细胞术和免疫组化染色的方法分析免疫小鼠外周血、脾脏和腹股沟淋巴结中CD4+、CD8+T淋巴细胞的差异;淋巴细胞增殖实验检测免疫28 d后小鼠外周血中淋巴细胞的增殖能力.结果 对重组质粒进行鉴定,结果显示重组质粒(PcDNA3.1-VP1、PcDNA3.1-VP2)构建成功;体外转染实验结果显示该纳米颗粒体外转染效率约为28％,具有较高的转染效率.ELISA检测显示VP1与VP2共同免疫小鼠血清中的抗体滴度均在初次免疫后的第21和28 d达到高,并显著高于对照组(F=4.625,P<0.05);流式和免疫组化染色结果分析发现VP1与VP2共同免疫小鼠血液、淋巴结和脾脏中CD4+、CD8+T淋巴细胞数均显著高于对照组;淋巴细胞增殖实验结果显示VP1与VP2共同免疫小鼠淋巴细胞增殖能力均显著高于对照组(F=12.73,P<0.05).结论 O型FMDV VP2的1-33肽段能增强VP1的141-160肽段的免疫原性,其可能通过激活细胞免疫和体液免疫实现.
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表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白的重组马立克氏病毒的构建
用聚合酶链式反应(PCR)方法从真核表达载体pcDNA3.1-VP2中扩增出包含CMV和polyA的VP2表达盒基因片段,经琼脂糖凝胶电泳大小为2.4kb;将该基因片段插入马立克氏病病毒(MDV)CVI988//Rispens的非必需区US10片段中,经SphI酶切分析获得大小为6.0和2.4kb两个片段,表明成功构建出表达VP2基因的MDV CVI988转移载体pUC18-US10-VP2质粒.将质粒与CVI988/Rispens疫苗毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过免疫荧光方法筛选,结果获得了表达VP2基因的重组MDV(rMDV-VP2).用IBDV特异性单克隆抗体进行间接免疫荧光试验(IFA)证实,rMDV-VP2病毒传至第8代仍能稳定表达VP2蛋白,这为进一步研究其免疫学特性奠定了基础.
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猪细小病毒vp2基因的表达和类病毒颗粒的构建
利用PCR方法从病毒基因组中获得了vp2完整的编码区并经测序后克隆到原核表达载体pET-32(a)上.在大肠杆菌中诱导表达了VP2与Trx-His-S Tag的融合蛋白,通过免疫家兔获得了高特异性的兔抗血清.另外,将vp2克隆到pFastBacDUAL载体上,利用昆虫表达系统,即AcMNPV的Bac-to-Bac系统对vp2进行了表达,经SDS-PAGE和Western blot分析,表达产物为64kD,并且该蛋白能在昆虫细胞中形成类病毒颗粒.
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TT病毒ORF2在Cos7细胞中的表达及蛋白质定位
应用PCR方法从含有TTVirus ORF2的质粒pET-His-TTV2中扩增出606bp的蛋白质编码区,并将其克隆到真核表达载体pEGFP-N1中以表达成GFP-VP2融合蛋白.构建出的重组质粒pEGFPTTV2经过酶切分析和PCR鉴定.用脂质体介导法将pEGFPTTV2质粒DNA转染Cos7细胞,通过RT-PCR分析,证实细胞中存在ORF2基因的转录产物.用共聚焦显微镜结合PI染色技术研究TTV VP2蛋白在细胞中的分布情况.结果表明,TTV VP2分布在细胞质中和细胞核膜内侧.因此推测VP2作为一种非结构蛋白,功能可能是参与病毒DNA的复制或转录.
关键词： 输血传播病毒(TTV)ORF2 GFP VP2 PI 蛋白质定位 -
传染性法氏囊病病毒不同分离株vp2基因部分核酸序列分析
根据已报告的传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)cDNA序列,设计引物,用RT-PCR扩增CH(鸡)、DU(鸭)、GE(鹅)和SP(麻雀)四种不同源IBDV分离株的vp2基因高变区.核酸序列测定分析表明,四种不同源IBDV分离株vp2基因高变区的同源性为97%,推导编码蛋白氨基酸序列的同源性98%,两个亲水区和七肽区的氨基酸序列完全一致.本研究结果提示,自然感染IBDV的鸭、鹅和麻雀不仅可成为病毒携带者或传染源,而且在病毒变异中起一定作用.
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131I标记新型小分子肽VP2
本文通过双功能偶联剂5-(三正丁基锡)-3-毗啶甲酸-N-琥珀酰亚胺酯(SPC)将131I标记到小分子融合多肽VP2上,研究了131I标记多肽VP2的体内外稳定性及在正常小鼠体内的代谢与分布.结果表明,该标记药物室温下放置48 h后放化纯度仍可达97％,其在小鼠体内可通过胃肠道快速代谢,在甲状腺的摄取较低.用间接标记法得到的131I-SPC-VP2在体内外有良好的稳定性.
