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周氏扶正抗癌合剂对人胃癌SGC7901细胞增殖和凋亡的影响(二)
(接上期)2 结果2.1 对正常人胚肾细胞HEK-293的影响由图4、5、6明显可见白英组的细胞南增殖速度比阴性对照略缓,而用扶正合剂刺激的细胞,其增殖速度远远低于阴性对照.
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马尾松树皮提取物对顺铂所致体外人胚肾细胞毒性的保护作用
目的:体外探讨马尾松树皮提取物(PMBE)对顺铂所致肾毒性的保护作用,并初步探究其作用机制.方法:体外培养人胚肾细胞HEK293,用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)方法分别检测PMBE、顺铂对HEK293细胞生长的影响,以及PMBE对顺铂所致HEK293细胞毒性的保护作用;并检测各组细胞内的活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)含量,以及过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和硫氧还蛋白酶(TrxR)的活性.结果:PMBE低浓度下促进HEK293细胞生长,较高浓度下对细胞产生轻微毒性;顺铂抑制HEK293细胞生长,使细胞内ROS,MDA含量升高,GSH含量降低,同时降低SOD,CAT和TrxR酶活性;加入PMBE预保护后,在一定范围内降低顺铂对HEK293细胞的损伤,降低ROS,MDA含量,升高GSH含量,以及提高SOD,CAT和TrxR酶活性.结论:一定浓度的PMBE对顺铂所致人胚肾细胞的毒性有保护作用,其机制可能与PMBE的抗氧化性密切相关.
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盐酸关附甲素对转染HERG基因表达的快速激活延迟整流钾通道电流的影响
目的 用膜片钳全细胞记录法观察盐酸关附甲素(AHH)对转染HERG基因表达的快速激活延迟整流钾电流(IKr)的影响.方法 使用脂质体介导的瞬时转染法把野生型HERG基因转染人人胚肾细胞(HEK293),采用标准的全细胞膜片钳技术记录IKr通道电流,观察不同浓度的AHH对IKr的影响.结果 AHH对IKr通道的峰电流IHERC具有浓度和电压依赖性抑制作用,半数大抑制浓度(IC50)为465.95 μmol/L;400 μmol/L的AHH使IHERG的大峰值电位前移,但不改变激活电位.25、100、400、1000、2500 μmol/L的AHH对尾电流(Itail)抑制率分别为1.53%、13.60%、-5.92%、30.14%、38.51%.100和400 μmol/L的AHH使激活曲线左移并能加快通道的失活.结论 25～400 μmol/L的AHH对IKr的抑制作用不明显;AHH主要是作用于IKr通道的失活态.
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汉坦病毒感染人胚肾细胞诱导凋亡的研究
目的 探讨汉坦病毒在人胚肾细胞(HEK-293)内的增殖及诱导凋亡的机制.方法 采用间接免疫荧光法检测HEK-293内汉坦病毒抗原,用westen blot方法测定汉坦病毒作用后bcl-2、bax、Cyt-c及caspase-3的表达.结果 汉坦病毒感染细胞后用间接免疫荧光法可在感染的HEK-293胞浆内检测出汉坦病毒抗原；Western blotting结果显示,随着汉坦病毒浓度增加,Bcl-2蛋白表达降低,Bax蛋白表达上调,Cyt-c蛋白及caspase-3酶原活化片段表达升高.结论 汉坦病毒可感染HEK-293细胞并在其体内增殖,可能通过线粒体途径诱导HEK-293细胞发生凋亡.
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亚硫酸钠对人胚肾293细胞炎性因子表达的影响
目的 探讨亚硫酸钠(Na2SO3)对人胚肾293(HEK293)细胞炎性因子表达的影响.方法 采用改进的单溶液噻唑兰(MTS)比色法观察0、0.002 5、0.01、0,039、0.156、0.625、2.5、10mmol/L亚硫酸钠对人胚肾293细胞株(HEK293)的毒性作用,并观察0、0.039、0.156、0.625、2.5、10 mmol/L亚硫酸钠染毒致HEK293细胞的形态学改变,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测HEK293细胞中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和白介素8(IL-8)的mRNA水平的改变.结果 细胞毒性实验显示,当亚硫酸钠浓度为0.625、2.5、10mmol/L时,OD值分别为(0.35475±0.021 24),(0.600 50±0.012 77),(0.784 75±0.009 85),均低于对照组(2.514 5±0.202 265),差异有统计学意义(P＜0.05);当亚硫酸钠浓度≤0.156mmoL/L时,OD 值范围为(2.473 75±0.069 99)～(2.625 00±0.12029),与对照组比较,差异无统计学意义.形态学观察发现,当接触亚硫酸钠浓度≥0.625 mmol/L时,细胞数量明显降低,细胞比较细长,突起较少;当亚硫酸钠浓度≤0.156mmol/L时.细胞数量和形态基本无变化.RT-PCR检测结果显示,0.039～10 mmol/L的亚硫酸钠对TNF-α、MCP-1和IL-8的mRNA表达无明显诱导作用.结论 亚硫酸钠对人胚肾细胞具有一定的抑制损伤作用,但对TNF-α、MCP-1和IL-8基因表达水平无影响,二者之间无明显关联.
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N-乙酰半胱氨酸对镉致人胚肾细胞凋亡拮抗作用
目的 探讨N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl cysteine,NAC)对氯化镉所致人胚肾(human ermbryonic kidney,HEK)细胞凋亡的拮抗作用.方法 应用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)比色法和流式细胞术(flowcytometry,FCM)检测不同CdCl2浓度(0,10,20,40,80 μmol/L)处理以及不同浓度NAC(1,2,4,8 mmol/L)和镉联合作用对HEK细胞相对存活率和凋亡率的影响.结果 单纯染镉时,与对照组(0 μmol/L)比较,20,40,80 μmol/L CdCl23组HEK细胞相对存活率明显降低(P＜0.01),HEK细胞凋亡率明显升高(P＜0.01);NAC与镉联合作用时,与40μmol/L CdCl2比较,40μmol/L CdCl2+4,8 mmol/L NAC2组HEK细胞相对存活率明显提高,40 μmol/L CdCl2+2,4,8 mmol/L NAC3组HEK细胞凋亡率明显降低.结论 一定浓度氯化镉可引起HEK细胞凋亡增加,NAC可以拮氯化镉引起的细胞凋亡.
关键词： 镉 人胚肾细胞 凋亡 N-乙酰半胱氨酸(NAC) -
Lipocalin-2基因表达产物对人胚肾细胞增殖的影响
目的 构建Lipocalin-2(Lcn-2)基凶真核表达质粒PL-2,并榆测其及前期原核表达的重组Lcn-2蛋白对人胚肾细胞HEK293增殖的影响.方法 利用RT-PCR从鼠巨噬细胞RAW264.7中扩增tcn-2基因,克隆人真核表达质粒pEGFP-C1中,构建蓖组质粒PL-2.转染HEK293细胞,通过荧光观察和RT-PCR鉴定Lcn-2基凶的表达.将重组质粒PL-2和前期原核表达的重组Lcn-2蛋白作用于HEK293细胞,通过MTT法检测细胞增殖情况,Western blot法检测细胞增殖核抗原(PCNA)的表达.结果 重组真核表达质粒PL-2经酶切和测序鉴定,证明构建正确.经荧光观察和RT-PCR鉴定,转染重组质粒PL-2的HEK293细胞中有Lcn-2基因的表达.加入重组Lcn-2蛋白后,HEK293细胞较对照组明显增殖,细胞中PCNA的表达也较对照组明显升高,而重组质粒PL-2对HEK293细胞增殖以及细胞中PCNA的表达均无影响.结论 已成功构建了Lcn-2基凶真核表达质粒,其对HEK293细胞的增殖无影响,而原核表达的重组Lcn-2蛋门对HEK293细胞的增殖有一定的促进作用,推测Lcn-2基因的表达产物可能通过与细胞膜受体结合促进HEK293细胞的增殖.
关键词： Lipocalin-2基因 真核表达 原核表达 人胚肾细胞 增殖 -
质谱检测叶酸缺乏人胚肾细胞中低组蛋白H3赖氨酸79甲基化修饰
目的:探讨叶酸(Folic acid,FA)缺乏在培养的人胚肾细胞(HEK-293)中对细胞组蛋白修饰水平的影响.方法:人胚肾细胞分两组培养,一组正常培养,一组无叶酸培养.细胞提取组蛋白后通过高效液相色谱一线性离子阱/静电场轨道阱高分辨质谱(HPLC-LTQ/Orbitrap Ms)检测组蛋白的修饰以比较叶酸缺乏对人胚肾细胞组蛋白修饰的影响.结果:用高分辨质谱方法成功检测到人胚肾细胞的五个组蛋白变体H1,H3,H4,H2a和H2b上的33个组蛋白修饰位点,其中23个修饰位点为uniprot数据库上已经报道的组蛋白修饰位点,而其余10个为未报道修饰位点.通过质谱比较正常和叶酸缺乏组人胚肾细胞修饰谱发现H3K79me1和H3K79me2在叶酸缺乏培养组中检出率较低.进一步用蛋白免疫印迹的方法也证明了在叶酸缺乏的人胚肾细胞中H3K79me1水平低于正常培养组.结论:细胞中叶酸缺乏影响组蛋白甲基化包括H3K79me2和H3K79me1修饰水平,提示细胞外营养因素叶酸水平可影响组蛋白修饰水平从而参与疾病如神经管畸形(Neural tube defect,NTD)的发生.
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FXR1基因与增强型绿色荧光蛋白融合载体的构建及表达
目的:构建携带人脆性X相关基因1(Fragile X related gene 1,FXR1)与增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent pro-tein,EGFP)的融合表达载体并进行表达,为研究FXR1基因在脆性X综合征中的作用机制奠定基础.方法:以重组质粒pYESTrp3/FXR1为模板,PCR扩增FXR1基因,将扩增片段双酶切后连接到质粒pEGFP-N1中,形成重组表达载体pEGFP-N1/FXR1,并用脂质体法转染人胚肾细胞,荧光显微镜下观察GFP在细胞内的表达及Western Blotting检测FXR1的表达情况.结果:成功构建融合表达载体pEGFP-N1/FXR1,在人胚肾细胞实现表达,检测到融合蛋白EGFP/FXR1.结论:本实验成功构建EFGP和FXR1重组共表达载体并可在真核细胞中表达,为进一步研究FXR1在脆性X综合征中的作用机理奠定基础.
关键词： 脆性相关基因Ⅰ(FXR1) 增强型绿色荧光蛋白 人胚肾细胞 -
容积性钙内流与花生四烯酸介导性钙内流之间的相互作用
目的在人胚肾细胞（HEK293 cells）研究容积性钙内流和花生四烯酸激活性钙内流的相互作用。方法采用荧光探针Fura2/AM技术测定HEK293细胞内钙对花生四烯酸、Thapsigargin反应变化。结果容积性钙内流可被花生四烯酸明显抑制，花生四烯酸所致钙内流亦可被容积性钙内流激动剂所抑制，这种交互抑制并非由药物化学性互相影响，肌浆网钙泵的抑制，钙池耗竭，或来自于容积性钙内流本身。相反，这种抑制可能与容积性钙内流激活过程和花生四烯酸激活过程相互作用有关。结论容积性钙内流与花生四烯酸所致的钙内流呈现相互抑制作用，这种抑制可防止细胞出现中毒性钙超载。
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藤茶活性成分二氢杨梅素对人胚肾细胞和肝细胞增殖的影响
目的 探讨藤茶活性成分二氢杨梅素(dihydromyricetin,DMY)对人正常细胞增殖的影响.方法 体外培养人胚肾细胞(HEK-293)和肝细胞(L-02),MTT法观察DMY对其细胞增殖的影响.结果 DMY对HEK-293和L-02细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为475.3 μg/mL和324.8 μg/mL,而阳性对照药物顺铂的IC50分别为7.4 μg/mL和7.7 μg/mL.结论 藤茶活性成分二氢杨梅素对人正常细胞HEK-293和人L-02细胞具有相对低毒性.
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用表达重组TSH受体的人胚肾细胞测定甲状腺刺激抗体和TSH刺激阻断抗体的研究
自身免疫性甲状腺疾病时,甲状腺的功能状态在一定程度上取决于患者体内的TSH受体抗体的水平及性质.如Graves甲亢时患者体内存在着刺激性TSH受体的抗体(TSAb),相反在50%的特发性粘液水肿病人血中存在着阻断性抗体(TSBAb).TSAb,TSBAb的测定是根据抗体与受体结合后的生物学效应来测定的.经典的方法是采用大鼠甲状腺细胞株(FRTL-5).但此细胞培养要求条件高,如特殊的培养基和各种激素,细胞的传代也很复杂,试剂昂贵,不利于常规开展.用人工表达重组TSH受体的真核细胞测定TSAb,TSBAb,国外已有报道[1].我们近来引进了表达重组TSH受体的人胚肾细胞(HEK-TSHR),此细胞易于生长,不需特殊培养基及添加成份.生长周期短,不需TSH饥饿.本研究旨在考察能否用HEK-TSHR代替FRTL-5细胞测定TSAb,TSBAb.
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载有人心肌细胞钠离子通道及PRKAG2基因的HEK-293T细胞模型的建立
目的 尝试建立类似PRKAG2心脏综合征钠离子通道功能的HEK-293T细胞模型,为探讨PRKAG2心脏综合征心律失常机制奠定基础.方法 分别构建人PRKAG2基因质粒载体和SCN5A基因质粒载体,共转人胚肾细胞(HEK-293T);应用免疫荧光法、Real-time PCR、蛋白质印迹法检测HEK-293T细胞转染结果及基因表达情况.结果 转染48 h后,HEK-293T细胞在细胞免疫荧光显微镜下可见红色荧光和绿色荧光.Real-time PCR及蛋白印迹结果证实:单独转染SCN5A组、SCN5A+ PRKAG2组、SCN5A+G100S组、SCN5A+ R302Q组SCN5A基因及蛋白均有表达,而在空白对照组无表达,差异有统计学意义(P＜0.05);SCN5A+PRKAG2组PRKAG2基因及蛋白高表达,而空白对照组、SCN5A组、SCN5A+ R302Q组、SCN5A+G100S组表达量较低,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 成功建立类似PRKAG2心脏综合征钠离子通道的HEK 293T细胞模型,为后续研究奠定了基础.
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人胰岛因子1基因启动子的克隆及活性鉴定
目的:克隆含人胰岛因子1 (islet1,ISL1)基因上游启动子序列的质粒并检测其在人胚肾HEK-293细胞中的启动子活性.方法:以HEK-293细胞提取的DNA为模板,PCR扩增ISL1基因启动子区全长1 419 bp片段;酶切后将此片段连接至pGL3-Basic载体,克隆含有ISL1基因启动子片段的重组质粒;以此重组质粒为模板重复上述步骤构建一系列ISL1启动子5'侧翼区截短质粒.将含ISL1启动子序列的重组质粒及其截短质粒转染至人胚肾HEK-293细胞,双荧光素酶报告基因检测各片段的启动子活性,找出启动子小活性区域,并通过生物信息学方法分析转录因子结合位点.结果:经酶切、测序鉴定,成功构建含有ISL1启动子序列的重组质粒及其截短质粒.与pGL3-Basic空载体相比,含有ISL1启动子序列的重组质粒启动子活性明显增加(P＜0.01).ISL1小活性区域位于转录起始位点-173 bp至-1 bp之间,其中包含OCT-1、MYOD、E2F2等多个转录因子结合位点.结论:人ISL1转录起始点上游1 215 bp区域在HEK-293细胞中具有较强启动子活性.
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镉诱导人胚肾细胞损伤分子机理的初步研究
目的初步探讨镉诱导人胚肾细胞损伤的细胞分子机理.方法采用MTT法,观察镉对人胚肾细胞损伤的影响;用流式细胞仪检测镉诱导人胚肾细胞凋亡;用分光光度计检测镉对肾细胞SOD活性的影响.结果几种不同剂量的镉加入细胞作用24 h,48h,72h后均能损伤肾细胞,抑制细胞生长;镉能诱导人胚肾细胞凋亡.并且能降低肾细胞SOD活性.结论镉对人胚肾细胞生长有一定的抑制作用,能诱导人胚肾细胞凋亡及抑制肾细胞SOD活性.
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腺病毒介导的hHCN4表达载体的构建及其转染人胚肾细胞
目的 构建人超极化激活环核甘酸门控通道基因4(hHCN4)的重组腺病毒载体pAV-hHCN4-IRES/eGFP,并对其进行鉴定、包装.方法 利用Gateway技术构建pAV-hHCN4-IRES/eGFP,酶切鉴定并进行阳性克隆测序.将构建好的质粒转染人胚肾细胞HEK293,检测病毒液滴度.结果 测序符合Genbank中的hHCN4的编码序列.转染HEK293细胞见绿色荧光蛋白表达,病毒滴度为1.26×108 pfu/ml.结论 成功构建了重组腺病毒载体pAV-hHCN4-IRES/eGFP.
关键词： 腺病毒 人超极化激活环核甘酸门控通道基因4 人胚肾细胞 -
丹参乙酸镁对人胚肾细胞内血红素加氧酶表达的影响
目的:以人胚肾细胞(HEK293T)为研究对象,进一步证实丹参乙酸镁(magnesium 1ithospermate B,LAB)对氧化应激下细胞内活性氧(reactiVe oxygen species,ROS)产生的影响;以血红素加氧酶-1(heme oxygenase,HO-1)为靶点,观察LAB对高糖诱导下HO-1表达的影响.方法:运用流式细胞仪检测细胞内ROS水平,RT-PCR和Western blotting分别检测高糖和LAB干预下,HEK 293T细胞内HO-1基因mR-NA和蛋白表达水平.结果:高糖和H2O2可使HEK293T细胞内ROS产生明显增多,LAB能够明显抑制应激状态时HEK293T细胞内ROS产生.HEK293T细胞给予高糖刺激后,HO-1 mR-NA表达和蛋白质表达均上调,于24 h达到高峰.HEK293T细胞预先30 min给予10、50和100mol/L 3个不同浓度的LAB干预后,与高糖对照组比较,HO-1 mRNA和蛋白质表达水平均有显著性的增加.结论:LAB不但可以直接清除氧化应激下细胞内过多的ROS,而且还可以通过激活下游基因HO-1的表达而发挥抗氧化作用.
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地高辛衍生物对人胚肾细胞293延迟整流钾电流的作用
目的 研究地高辛衍生物对人胚肾细胞(human embryonic kidney 293 cell,HEK-293)上延迟整流钾电流(delayed after potassium current,IK)的影响.方法 应用磷酸钙瞬时转染的方法,将人心肌细胞上的延迟整流钾电流通道蛋白基因(human Ether-a-go-go Related Gene,HERG)转染进人胚肾细胞,全细胞膜片钳技术记录药物浓度分别为1、10、100 nmol·L-1的地高辛甲、乙两种衍生物对人胚肾细胞上HERG钾通道时间依赖性电流(Istep)和尾电流(I tail)的影响.结果 地高辛衍生物甲和地高辛类似,对HERG钾通道时间依赖性电流和尾电流均呈现剂量依赖性抑制,其半数大抑制浓度IC50分别为20.61、22.69 nmol·L-1;未见地高辛衍生物乙对HERG钾通道延迟整流钾电流的抑制作用.结论 地高辛衍生物甲对转染HERG钾通道的人胚肾细胞的延迟整流钾电流呈浓度依赖性抑制;而地高辛衍生物乙对转染HERG钾通道的人胚肾细胞的延迟整流钾电流无抑制作用.
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人胆固醇酯水解酶重组腺病毒载体的构建
目的 构建人胆固醇酯水解酶(hCEH)基因重组腺病毒载体,并在人胚肾细胞(HEK293)中扩增.方法 将hCEH基因整合入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-hCEH,线性化后与pAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,获得含目的基因的重组质粒pAd-hCEH,酶切后用脂质体转染HEK293,包装成重组体腺病毒Ad-hCEH,经扩增和纯化得到高滴度重组病毒.采用PCR法进行鉴定,绿色荧光蛋白(GFP)追踪,荧光显微镜下观察并计算Ad-hCEH病毒滴度.结果 重组穿梭质粒及其载体经鉴定后,电泳结果与预期相符.Ad-hCEH-EGFP感染HEK293后,随时间增加,HEK293表达绿色荧光的量也增加.hCEH碱基序列经测序与Genebank中已知序列完全吻合.Ad-hCEH电泳结果显示1 700 bp附近有一条带,与目的片段相符合.终测得Ad-hCEH滴度为1.2×1010 pfu/ml.结论 成功构建了携带hCEH基因的重组腺病毒载体.
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西沙比利对HERG基因表达的快速激活延迟整流钾通道电流及蛋白的影响
目的 评价西沙比利对转染HERG基因表达的快速激活延迟整流钾电流(IKr)和蛋白的影响,探讨其致心律失常的机制.方法 使用脂质体介导的瞬时转染法把野生型HERG基因转染进人胚肾细胞(HEK293),采用全细胞膜片钳技术评价西沙比利对IKr通道电流和动力学的影响;使用G418筛选出稳定转染HERG的细胞,并用西沙比利进行干预,应用免疫蛋白印迹技术评价药物对蛋白的影响.结果 西沙比利对IKr通道的刺激电流(IHERG)和尾电流(Itail)具有浓度和电压依赖性抑制作用,半数大抑制浓度分别14.5和3.9 nmol/L.西沙比利使IHERG和Itail的大峰值电位前移,但不改变激活电位;使激活曲线左移并加快通道的失活,但不改变通道失活后的恢复时间;西沙比利对转染后的HEK293细胞上的IKr通道蛋白无明显抑制.结论 西沙比利通过作用于通道的失活态抑制HERG钾电流,但不影响HERG通道蛋白的表达.
