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外周注射福尔马林诱导大鼠前扣带皮层中ERK-CREB的激活
目的 研究外周福尔马林刺激诱导的大鼠前扣带皮层中细胞外信号调节激酶(ERK)和cAMP反应元件结合蛋白(CREB)的激活.方法 大鼠单侧足底皮下注射5%的福尔马林,在刺激后的不同时间点将大鼠进行灌注固定或直接取前扣带皮层组织,用免疫组织化学和Western blotting方法观察前扣带皮层中磷酸化ERK和磷酸化CREB的激活情况.结果 单侧足底皮下注射福尔马林能诱导双侧前扣带皮层中ERK和CREB的磷酸化.磷酸化的ERK和磷酸化CREB的表达高峰分别在刺激后的3min和30min.非磷酸化的CREB和ERK没有显著变化.结论 大鼠前扣带皮层能够接受外周伤害性信息的传入,激活的ERK和CREB可能与疼痛的原发性不愉快有关.
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丹参酮ⅡA可激活 Nrf2/ARE通路对帕金森病 MPTP模型小鼠多巴胺能神经元起保护作用
目的：：研究Nrf2/ARE通路在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP)所致帕金森病(PD)动物模型发病机制中可能的作用,探讨导致多巴胺(DA)能神经元变性坏死的可能机制,以及丹参酮ⅡA对Nrf2/ARE通路的影响和对多巴胺能神经元的保护作用。方法：将60只C57 BL/6 N小鼠随机分为对照组、PD模型组和丹参酮ⅡA组,每组20只。 PD模型组和丹参酮ⅡA组小鼠采用MPTP制备PD小鼠模型,丹参酮ⅡA组制备PD模型后腹腔注射丹参酮ⅡA。观察各组小鼠行为学表现,采用免疫组织化学、免疫蛋白印迹和免疫荧光双标法检测各组小鼠中脑黑质区酪氨酸羟化酶(TH)、核转录因子(Nrf2)、醌氧化还原酶(NQO1)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞数和蛋白表达水平。结果：与对照组比较,PD模型组小鼠出现典型的PD样症状。在MPTP后一次注射后48小时,黑质区TH阳性神经元数量和蛋白表达水平明显下降,Nrf2、NQO1和GFAP阳性细胞数量和蛋白表达水平明显增加( P<0.01),在MPTP后一次注射后7天,黑质区TH 阳性神经元数量和蛋白表达水平较对照组减少约45%和50%( P<0.01)。与PD模型组比较,丹参酮ⅡA组小鼠PD样症状减轻,在MPTP后一次注射后48小时,中脑黑质区Nrf2、NQO1和GFAP阳性细胞数量和蛋白表达水平进一步升高( P<0.01),在MPTP后一次注射后7天,黑质区TH阳性神经元数量和蛋白表达水平明显升高( P<0.01)。结论：Nrf2/ARE通路在急性PD模型DA能神经元内可能被激活,其可能通过上调NQO1的表达对黑质DA能神经元起到保护作用,丹参酮ⅡA可能通过激活Nrf2/ARE通路对小鼠多巴胺能神经元起到一定保护作用。
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WEE1与肝癌的关系
目的:探讨WEE1在肝细胞癌(HCC)发生、发展中的异常表达及与肿瘤病理分期的关系.方法:收集2010-03/2010-05河南省人民医院肝胆外科手术标本正常肝组织23例,肝硬化20例,HCC 42例.采用RT-PCR检测mRNA水平的表达,Western blot及免疫组织化学检测蛋白的表达,并分析其与肝癌临床病理学分期的关系.结果:WEE1 mRNA阳性表达率分别为2 1.7%、55.0%和90.5%,三组间差异有统计学意义(P＜0.01).Western blot和免疫组织化学方法分别检测蛋白阳性表达率分别为13.04%/17.4%、40%/60%和78.6%/83.3%,三组问相比差异有统计学意义(P<0.01).肝癌组织中WEE1强度与肿瘤的分化程度及病理分级相关(x2=17.454,P<0.01;x2=14.559,P<0.01).结论:WEE1基因在肝癌中呈上调表达,其参与的DNA的修复异常与肝癌的发生密切相关,且与肿瘤的分化程度和病理分级相关.
关键词： 逆转录聚合酶链式反应 免疫蛋白印迹 免疫组织化学 肝细胞癌 WEE1 -
FAK-ERK信号转导通路在FRNK抑制肝星状细胞胶原合成中的作用
目的:探讨FAK-ERK信号转导通路在黏着斑激酶相关非激酶(FAK-related non-kinase,FRNK)质粒转染抑制肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)胶原合成中的作用.方法:在体外,以FN诱导HSCs增殖,采用脂质体介导的方法用FRNK表达质粒瞬时转染HSCs,利用3H-Pro掺入技术测定HSCsⅠ型胶原的合成,Western blot及RT-PCR方法检测FRNK、FAK、p-FAK(Tyr397)、ERK蛋白和mRNA的表达.结果:FRNK表达质粒成功转染HSCs,在翻译后水平抑制FAK磷酸化.在FRNK转染HSC48 h后胶原合成能力较空质粒组显著下降(498.17±73.20 vs 748.33±61.30,P<0.01).FRNK抑制FAK磷酸化和在翻译和转录水平抑制ERK1、p-ERK的表达,而FN则促进FAK和ERK1、p-ERK在翻译和转录水平的表达.结论:FRNK可以使HSCs胶原合成能力降低,FAK-ERK信号转导通路可能发挥了负调控作用.
关键词： 肝星状细胞 黏着斑激酶相关非激酶 细胞外信号调节激酶 胶原 免疫蛋白印迹 -
靶向XIAP的shRNA重组质粒的构建
目的:设计以X染色体连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)为靶向的shRNA,构建携带此shRNA的重组质粒,检测其抑制XIAP表达的效应,筛选RNA干扰作用强的shRNA片段.方法:设计4对针对XIAP基因不同位点的shRNA片段,构建携带此shRNA片段的真核表达载体psiRNA-Hhneo-XIAP,通过脂质体介导的方法将重组质粒转染到肝癌细胞株HepG2细胞中.采用逆转录酶链式反应(RT-PCR)及蛋白印迹(Western blotting)方法检测XIAP的mRNA及蛋白表达情况,比较转染前后其表达差异,以判断各sbRNA的干扰效应.结果:成功构建含shRNA片段的重组质粒.经质粒测序证实,插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致.重组质粒转染HepG2细胞后,XIAP基因的mRNA水平及蛋白表达水平明显下调,其中以1号重组质粒效应强.shRNA作用48 h后,对HepG2细胞中XIAP mRNA和蛋白的抑制率与3,4号重组质粒相比,均具有显著性差异(mRNA:94.5%vs 81.5%,82.6%,均P＜0.01:蛋白:92.6% vs 80.7%,82.9%,均P＜0.01).结论:成功构建了携带以XIAP为靶向的shRNA的重组质粒,其对肝癌细胞内XIAP的表达具有显著抑制效应.
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促性腺激素释放激素受体在宫颈上皮内瘤样病变中表达及临床意义
目的:探讨促性腺激素释放激素受体(GnRHR)在宫颈上皮内瘤样变中表达及其临床意义.方法:采用免疫组织化学SP法和免疫蛋白印迹检测43例宫颈上皮内瘤样变(CIN)其中标本中GnRHR的表达.结果:宫颈上皮内瘤样变中,GnRHR呈阳性表达,在CINⅠ、CINⅡ和CINⅢ组织中GnRHR表达率和表达量呈增高趋势,3组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论:CIN表达GnRHR, CIN中异型性的鳞状上皮细胞自身可能合成GnRHR,且在CIN中GnRHR阳性表达情况与细胞异型程度有关, GnRHR可能参与CIN细胞增殖.
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COX-2在子宫内膜间质肉瘤中的定位及定量的表达研究
目的：探讨COX-2在子宫内膜间质肉瘤的发生发展中所起的作用和临床意义。方法：1997年至2014年大庆龙南医院妇科曾收住院的不同临床分期的子宫内膜间质肉瘤的患者标本20例作为实验组，正常子宫内膜20例作为对照组。采用免疫组化（sP）法，定位、定量检测子宫内膜间质肉瘤及正常子宫内膜组织中的COX-2，Western blot免疫印迹法，定量检测两组中的COX-2。结果：免疫组化及West-ern blot分析显示，实验组的COX-2的表达高，与对照组有显著性差异（P＜0.05）。结论：COX-2在子宫内膜间质肉瘤中有高表达，可以为治疗子宫内膜间质肉瘤上提供新思路。
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咖啡酸苯乙酯靶向调控人结肠癌HT-29细胞FAK-ERK信号通路的研究
目的 探讨咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester,CAPE)对结肠癌HT-29细胞FAK-ERK信号转导通路中相关蛋白表达的作用,寻找其作用靶点,试图阐明CAPE抗肿瘤作用的分子机制.方法 用不同浓度CAPE处理HT-29细胞,利用Hoechst33258染色法和流式细胞术,检测细胞凋亡的发生.应用Western印迹法分析不同浓度CAPE对HT-29细胞中黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)和细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)蛋白表达的影响.结果 Hoechst33258染色发现CAPE作用后凋亡细胞数量增加.流式细胞仪细胞凋亡率分析显示,0,2.5,5.0,7.5和10 μg/ml处理HT-29 细胞24 h后,细胞凋亡率上升,呈剂量依赖性.Western印迹结果显示,在0～10 μg/ml范围内不同浓度CAPE作用于HT-29细胞24 h后,FAK、ERK蛋白表达随CAPE浓度的增加而下调.结论 CAPE可诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡,其作用机制可能与CAPE抑制FAK-ERK信号转导通路的激活有关.
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α-enolase在大肠癌与癌旁组织中的表达及意义
目的 观察α-enolase在大肠癌中的表达情况及意义,探讨其与大肠癌发生发展及转移的关系.方法 采用液质联用技术对18例大肠癌患者的癌组织和癌旁组织进行蛋白质谱的检测、鉴定和分析,并通过免疫蛋白印迹实验进一步确证.结果 α-enolase在大肠癌组织中表达高于癌旁正常组织.结论 高表达的α-enolase可能与大肠癌的发生发展有关.
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活体脊髓取材吹出法与传统方法的比较
脊髓的神经细胞培养、免疫蛋白印迹、酶联免疫等实验研究都需要提取动物的活体脊髓组织。脊髓的单细胞膜片钳和薄片膜片钳等电生理学研究方法，对脊髓细胞活性的要求较高，快速提取结构完整的脊髓显得更为重要[1]。但脊髓在椎管和硬脊膜的保护下，难以提取。通过改良杜俊英等[2]所介绍的固定脊髓提取方法，应用于大鼠和小鼠的活体脊髓取材，并将其效果与传统方法进行比较。该方法是利用注射器和微量移液器枪头，将活体脊髓从两端离断的椎管中吹出的提取方法。吹出法与传统方法相比，取材时间显著缩短，脊髓灰质中大部分细胞活性很好。
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Fibulin-1在女性压力性尿失禁患者盆底组织中的表达及意义
目的 探讨压力性尿失禁( SUI)患者阴道前壁中Fibulin-1与SUI发生的关系.方法 采用实时荧光定量-PCR、免疫蛋白印迹方法测定25例压力性尿失禁患者(SUI组)阴道前壁组织中Fibulin-1的蛋白及mRNA表达水平,择同期27例非卵巢功能性肿瘤和宫颈病变患者作为对照(对照组).结果 RT-PCR结果显示Fibulin-1mRNA表达水平△Ct值在SUI组织(0.456 5±0.220 6)明显低于对照组组织(0.246 8±0.5017) (F =0.241,P＜0.001);Fibulin-1 mRNA表达水平△Ct值在SUI绝经前组组织(0.373 2±0.158 2)明显低于绝经前对照组组织(1.157 5±0.1542)(F=0.212,P＜0.001);Fibulin-1 mRNA表达水平△Ct值在SUI绝经后组组织(0.557 3±0.2219)与绝经后对照组组织(0.5326±0.2221)都很微弱,(F=1.099,P＞0.05).结论 SUI患者的盆底支持结构的退行性病变与组织中的Fibulin-I低下有关.
关键词： 尿失禁 压力性 Fibulin-1 实时荧光定量-PCR 免疫蛋白印迹 -
速避凝对胃癌患者围术期血小板膜糖蛋白CD41、CD62p表达的影响
肿瘤患者血小板活化与术后肿瘤的生长、转移、扩散及血栓形成相关[1],探索削弱或减轻血小板活化水平是麻醉及肿瘤学研究中所关注的课题.
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LyGDI在肺癌组织中的表达及临床意义
目的 研究LyGDI在肺癌组织中的表达及临床意义.方法 用免疫蛋白印迹法分析肺癌及癌旁正常组织中LyGDI蛋白的表达情况.结果 37份配对组织标本中.LyGDI在29份肺癌组织中的表达明显高于其相应的癌旁正常组织,差异有统计学意义(P
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山茱萸环烯醚萜苷对局灶性脑缺血模型大鼠BDNF及其受体TrkB表达的影响
我们的系列研究发现,在局灶性脑缺血/再灌注大鼠模型上,山茱萸环烯醚萜苷(cornel iridoid glycoside,CIG)具有良好的缺血保护作用,能够明显改善模型大鼠的神经功能,减小脑梗死体积,其作用机制与抗氧自由基、抑制炎性反应、促进血管内皮生长因子及其受体的表达、促进神经发生和血管新生等有关[1～5].为了进一步探讨脑缺血后CIG神经保护的作用机制,本研究观察了CIG对局灶性脑缺血大鼠大脑皮质脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)及其受体TrkB表达的影响,旨在为将CIG开发成治疗缺血性脑损伤的新药提供实验依据.
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非小细胞肺癌组织ZO-1蛋白表达检测及其临床意义
目的:探讨NSCLC(Non Small Cell Lung Cancer,非小细胞肺癌)患者中ZO-1(zonula occluden-1,紧密连接蛋白-1)蛋白检测的临床意义.方法:应用western blot检测101名NSCLC患者癌组织及癌旁组织ZO-1蛋白的表达,以61名肺部良性病变患者作为对照.结果:ZO-1蛋白在癌组织中表达低于癌旁组织,差异具有显著统计学意义(P<0.01);ZO-1蛋白在癌旁组织中表达低于对照组,差异具有显著统计学意义(P<0.05).癌旁组织ZO-1蛋白在淋巴结未转移组中表达高于淋巴结转移组,差异具有显著统计学意义(t=-4.44,P<0.01),在2年生存组中表达高于2年死亡组,差异具有显著统计学意义(t=3.62,P<0.01);癌组织中ZO-1蛋自在2年生存组中表达高于2年死亡组,差异具有显著统计学意义(t=2.52,P<0.05)结论:癌旁组织中ZO-1蛋白和NSCLC患者淋巴结转移明显相关,癌旁组织和癌组织中ZO-1蛋白和NSCLC患者2年生存率明显相关.
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神经酰胺合成酶在肾癌组织中的表达
目的 研究神经酰胺合成酶(GCS)在肾癌组织中的表达及作用.方法 采用Western-blot方法 检测GCS在肾癌组织及癌旁组织中的表达情况.结果 GCS在肾癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P＜0.01).结论 GCS在肾癌组织发生、发展过程中可能起重要的调控作用.
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西沙比利对HERG基因表达的快速激活延迟整流钾通道电流及蛋白的影响
目的 评价西沙比利对转染HERG基因表达的快速激活延迟整流钾电流(IKr)和蛋白的影响,探讨其致心律失常的机制.方法 使用脂质体介导的瞬时转染法把野生型HERG基因转染进人胚肾细胞(HEK293),采用全细胞膜片钳技术评价西沙比利对IKr通道电流和动力学的影响;使用G418筛选出稳定转染HERG的细胞,并用西沙比利进行干预,应用免疫蛋白印迹技术评价药物对蛋白的影响.结果 西沙比利对IKr通道的刺激电流(IHERG)和尾电流(Itail)具有浓度和电压依赖性抑制作用,半数大抑制浓度分别14.5和3.9 nmol/L.西沙比利使IHERG和Itail的大峰值电位前移,但不改变激活电位;使激活曲线左移并加快通道的失活,但不改变通道失活后的恢复时间;西沙比利对转染后的HEK293细胞上的IKr通道蛋白无明显抑制.结论 西沙比利通过作用于通道的失活态抑制HERG钾电流,但不影响HERG通道蛋白的表达.
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卵巢肿瘤组织MTRR蛋白表达检测及其临床意义
目的 探讨卵巢恶性肿瘤组织中亚甲基四氢叶酸 高半胱氨酸甲基转移还原酶(MTRR)的表达及其临床意义.方法 采用Western blot检测80例卵巢恶性肿瘤组织、50例卵巢良性肿瘤组织及40例正常卵巢组织中的MTRR表达情况,分析其与卵巢恶性肿瘤临床病理及多药耐药的相关性.结果 (1) MTRR在卵巢正常组织、卵巢良性肿瘤和卵巢恶性肿瘤中的表达量依次增高(P＜0.05).(2) MTRR在卵巢恶性肿瘤临床分期中Ⅰ～Ⅱ期的表达量低于Ⅲ～Ⅳ期,在组织分级高分化中的表达量低于中低分化(P＜0.05).(3)MTRR在铂类药物耐药型卵巢恶性肿瘤中的表达量高于铂类药物敏感型(P＜005)；在治疗后肿瘤进展者中的表达量高于缓解者(P＜0.01).(4)MTRR在黏液性肿瘤中的表达量低于浆液性肿瘤(P＜0.05),在远处器官转移的恶性卵巢肿瘤中高于未有转移者(P＜0.01),与患者是否有大网膜转移和腹水量多少无明显相关(P＞0.05).(5)MTRR表达量判断卵巢肿瘤性质的ROC曲线Youden指数大值为0.681,卵巢恶性肿瘤MTRR表达量的高低与中位生存时间长短差别无明显相关(P＞005),Cox模型多因素分析显示MTRR表达量不是影响患者生存预后的独立因素.结论 MTRR蛋白过表达与卵巢恶性肿瘤的发生发展相关,MTRR蛋白过表达可作为判断肿瘤性质和铂类多药耐药潜在标志物之一.
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糖皮质激素快速激活PC12细胞Erk1/2 MAPK
目的:研究皮质酮在PC12细胞是否能激活Erk1/2 MAPK及探讨其胞内信号转导机制.方法:(1)PC12细胞培养;(2)免疫蛋白印迹(Western blotting)法检测Erk1/2 MAPK的磷酸化;(3)用间接免疫荧光染色法观察激活的Erk 1/2 MAPK由胞质向核转位的情况;(4)MAPK活性直接测定法.结果:(1)皮质酮可以浓度依赖性方式刺激MAPK磷酸化,激活曲线为钟形,大激活浓度为10-9 mol/L(时间为15 min);(2)皮质酮以时间依赖性方式刺激MAPK磷酸化,皮质酮作用5 min时,有Erk1/2 MAPK激活,大激活时间为15 min;(3)皮质酮、B-BSA(皮质酮偶连的牛血清白蛋白)和NGF可激活Erk1/2 MAPK活性,Erk1/2 MAPK的激活可能不是由经典的糖皮质激素受体介导,因为B-BSA能快速激活Erk1/2 MAPK;(4)MAPK激酶抑制剂(PD98059)可抑制皮质酮诱导的Erk1/2 MAPK磷酸化,进一步证明皮质酮激活Erk1/2 MAPK;(5)皮质酮、B-BSA和NGF可引起Erk1/2 MAPK核转位,免疫荧光染色结果显示15 min时,由皮质酮和B-BSA激活的Erk1/2 MAPK从胞质转移到细胞核;(6)皮质酮可通过蛋白激酶C激活Erk 1/2 MAPK,蛋白激酶C激活剂(PMA)能激活Erk1/2MAPK,而蛋白激酶C抑制剂(G6976)能阻断皮质酮诱导的Erk1/2 MAPK激活.结论:本研究首次发现皮质酮在PC12细胞能快速激活Erk1/2 MAPK,并清楚地显示皮质酮可能作用在细胞膜上通过蛋白激酶C激活Erk1/2 MAPK.
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结肠腺瘤性息肉病基因蛋白在二甲肼诱导大鼠大肠癌过程中的表达
目的：观察结肠腺瘤性息肉病基因（APC）蛋白在二甲肼诱导大鼠大肠癌形成过程中的表达，为大肠癌的靶向治疗和早期诊断提供新思路。方法将雄性 SD 大鼠60只随机分为正常对照组和模型组，应用免疫印迹法和免疫组织化学 SP 法，检测20例大肠癌组、20例大肠腺瘤组及20例正常对照组大鼠大肠黏膜组织中 APC 蛋白的表达情况。结果免疫组织化学检测结果显示，APC 蛋白在正常对照组大鼠大肠黏膜组织中均呈强阳性表达，在大肠腺瘤和大肠癌组大鼠大肠组织中未见表达；免疫蛋白印迹检测结果显示，正常大肠黏膜组织均表现为包含有1条相对分子质量约为300×103的特异性条带，而大肠癌和大肠腺瘤黏膜组织却均不含有该条带。结论APC 蛋白在大肠腺瘤和大肠癌组织中呈不表达状态，而在正常大肠黏膜组织中呈强表达状态，提示其与大肠癌的发生、发展过程关系密切，可望成为大肠癌的肿瘤标志物。
关键词： 结肠腺瘤性息肉病基因 免疫组化 大肠癌 二甲肼 免疫蛋白印迹
