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人胰岛素样生长因子-1基因的克隆、表达和活性检测
目的克隆人胰岛素样生长因子Ⅰ型(hIGF-1),构建真核表达载体并进行表达及活性检测,为IGF-1基因治疗糖尿病奠定基础.方法提取胎儿肝脏总RNA,RT-PCR法扩增IGF-1cDNA片段,重组于pUCM-T载体,测序正确后构建表达载体,转染猴肾成纤维细胞系COS-7,用原位杂交和免疫组织化学检测表达,收集培养上清以胰岛素刺激释放实验进行活性测定.结果扩增得到710 bp带有Kozak序列的IGF-1cDNA片段;成功构建了真核表达载体pCI-neo/hIGF-1;IGF-1在COS-7细胞得到了表达,并具有刺激胰岛素分泌的活性.结论新构建的载体pCI-neo/hIGF-1能在COS-7细胞中表达、分泌,且所分泌的IGF-1具有生物活性.
关键词： 人胰岛素样生长因子Ⅰ 克隆 表达 生物活性 -
腺病毒介导的hIGF-Ⅰ基因转染对构建组织工程软骨的影响
目的 探讨腺病毒介导的人胰岛素样生长因子I(hIGF-Ⅰ)基因转染对构建组织工程软骨的影响.方法 分离新两兰大白兔关节软骨细胞,培养到第一代,用荧光标记的Ad/hrGFPhlGF-Ⅰ转染,然后接种在PLGA支架上(转染组);未转染的软骨细胞接种在PLGA支架上(对照组),在体外培养2周.利用荧光显微镜、Western blot、RT-PCR、免疫组织化学等方法鉴定hIGF-Ⅰ基因的有效转染,并观察其对构建的组织工=程软骨细胞外基质的影响.结果 Ad/hrGFP-hlGF-Ⅰ能对兔关节软骨细胞进行有效转染,RT-PCR显示构建的组织工程软骨Ⅰ、Ⅱ型胶原、聚合素的表达高于对照组;定昔检测显示胶原和GAG的含量高于对照组(P＜0.01).结论 腺病毒介导的hIGFⅠ基因转染能成功转染兔关节软骨细胞,用它构建组织工程软骨能显著促进软骨细胞外基质的合成.
关键词： 人胰岛素样生长因子Ⅰ 腺病毒 软骨细胞 -
人胰岛素样生长因子Ⅰ基因对兔关节软骨细胞的有效转染及表达
目的 研究人胰岛素样生长因子Ⅰ(hIGF-Ⅰ)基因构建的真核表达载体质粒对兔关节软骨细胞的有效转染和表达.方法 将hIGF-Ⅰ基因构建在pcDNA 3.1质粒上,经FuGENE 6介导转入兔关节软骨细胞;设未转hIGF-Ⅰ基因软骨细胞作对照.转染后第3天用RT-PCR技术检测hIGF-Ⅰ、Ⅱ型胶原和聚合素在mRNA水平的表达,用细胞爬片免疫组织化学和Western blot测定hIGF-Ⅰ在蛋白水平的表达.结果 RT-PCR显示hIGF-Ⅰ在转染组中琼脂糖电泳318 bp处见到相应的目的 条带,而对照组未出现目的 条带;Ⅱ型胶原和聚合素在转染和对照组中以β-actin为参照半定量检测分别增加到1.3倍和1.4倍(P<0.05).免疫组织化学显示转染组细胞爬片有hIGF-Ⅰ表达的棕黄色颗粒,对照组胞浆中未见棕黄色颗粒,转染组胞浆中出现大量的Ⅱ型胶原棕黄色颗粒.Western blot显示转染组细胞在7.6 KDa标记处有hIGF-Ⅰ的蛋白条带出现对照组则没有.结论 FuGENE 6介导的重组hIGF-Ⅰ基因真核表达载体质粒可有效转染兔关节软骨细胞,在mRNA和蛋白水平上有效表达hIGF-Ⅰ及Ⅱ型胶原,表达的hIGF-Ⅰ能在mRNA水平上增加Ⅱ型胶原和聚合素的合成,保持软骨细胞表型的稳定.
关键词： 人胰岛素样生长因子Ⅰ 关节软骨细胞
