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腺病毒载体系统文献资料
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人胆固醇酯水解酶重组腺病毒载体的构建
目的 构建人胆固醇酯水解酶(hCEH)基因重组腺病毒载体,并在人胚肾细胞(HEK293)中扩增.方法 将hCEH基因整合入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-hCEH,线性化后与pAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,获得含目的基因的重组质粒pAd-hCEH,酶切后用脂质体转染HEK293,包装成重组体腺病毒Ad-hCEH,经扩增和纯化得到高滴度重组病毒.采用PCR法进行鉴定,绿色荧光蛋白(GFP)追踪,荧光显微镜下观察并计算Ad-hCEH病毒滴度.结果 重组穿梭质粒及其载体经鉴定后,电泳结果与预期相符.Ad-hCEH-EGFP感染HEK293后,随时间增加,HEK293表达绿色荧光的量也增加.hCEH碱基序列经测序与Genebank中已知序列完全吻合.Ad-hCEH电泳结果显示1 700 bp附近有一条带,与目的片段相符合.终测得Ad-hCEH滴度为1.2×1010 pfu/ml.结论 成功构建了携带hCEH基因的重组腺病毒载体.
