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055副溶血性弧菌溶血素基因及其检测的研究进展
副溶血性弧菌是一种重要的食源性致病菌,可引起急性胃肠炎和原发性败血症.副溶血性弧菌能够产生3类溶血素,包括不耐热溶血素(TLH)、耐热直接溶血素(TDH)和TDH相关溶血素(TRH).TLH、TDH和TRH分别由tlh、tdh和trh基因编码.副溶血性弧菌溶血素基因的检测通常采用PCR和核酸杂交,复合PCR和实时荧光定量PCR是未来检测技术应用的趋势.
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微孔杂交技术诊断肺外结核
目的将聚合酶链反应(PCR)、核酸杂交、酶联免疫吸附三种技术有机结合,从分子水平检测结核杆菌,为临床诊断肺外结核提供病原学依据.方法使用生物素标记的特异性引物扩增结核杆菌(TB)DNA,带有生物素的产物与包被在微孔板内的靶基因杂交,加入酶标链毒亲和素与生物素结合,后加辣根过氧化物酶显色,2M H2SO4终止反应.根据酶标仪检测各孔吸光度判断结果.结果通过对临床高度怀疑为肺外结核的408份标本的检测,PCR-微孔板杂交法的检出率为43.6%,培养法的检出率为25.9%直接涂片抗酸染色为6.4%.结论 PCR杂交法灵敏度高,特异性强,有助于临床准确、快速诊断肺外结核.
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两种分子检测技术快速诊断骨关节结核及其耐药性的研究
目的 评价两种分子检测技术——利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(Xpert Mtb/RIF,简称"Xpert")和GenoType? MTBDRplus线性探针检测技术(简称"MTBDR")快速诊断骨关节结核及其耐药性的临床应用价值.方法 2014年3-6月连续收集北京胸科医院住院的60例疑似骨关节结核患者的脓标本,每份标本行涂片抗酸杆菌检查、MGIT960分枝杆菌培养、Xpert和MTBDR检测,培养阳性的结核分枝杆菌行绝对浓度法药物敏感性试验(DST)检测.以临床诊断参考标准(CRS)为金标准,评价Xpert和MTBDR检测脓标本中结核分枝杆菌的敏感度和特异度.以DST为金标准,评价Xpert和MTBDR检测脓中结核分枝杆菌耐药性的敏感度和特异度.结果 以CRS为金标准,涂片、培养、Xpert和MTBDR的敏感度分别为26.00％ (13/50)、48.00％ (24/50)、82.00％ (41/50)和72.00％ (36/50),10例非结核病患者脓标本4种技术检测结果均为阴性.以DST为金标准,6例RFP耐药样本中,Xpert检测RFP耐药全部阳性,MTBDR检测RFP耐药5例阳性;18例RFP敏感样本中2种技术检测结果均为阴性.7例INH耐药样本中,MTBDR检测INH耐药6例阳性;17例INH敏感样本中MTBDR技术检测结果均为阴性.结论 Xpert和MTBDR检测脓标本中结核分枝杆菌的敏感度和特异度高,并且可同时检测其耐药性,可用于早期诊断骨关节结核及其耐药性.
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PCR-ELISA微孔板杂交技术检测结核杆菌DNA
目的采用PCR-ELISA微孔板杂交技术检测结核杆菌DNA.方法采用PCR技术扩增结核杆菌DNA,并将扩增产物加入预先包被结核杆菌探针的微孔板,再加入结核杆菌显色探针,同时进行微孔板核酸夹心杂交ELISA显色.共检测肺部疾病患者痰标本510例.结果该法的灵敏度为59.3%,特异性为95.0%;阳性预测值为96.3%,阴性预测值为51.4%.结论 PCR-ELISA微孔板杂交技术可快速、准确地检测结核杆菌DNA,是结核病早期诊断和鉴别诊断的可靠实验室方法.
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应用rpoB基因PCR反向斑点杂交快速鉴定分枝杆菌菌种的研究
目的 根据分枝杆菌rpoB基因序列建立一种准确、快速的分枝杆菌菌种鉴定方法.方法以分枝杆菌rpoB基因编码序列为靶基因,用聚合酶链反应(PCR)反向斑点杂交技术检测24种分枝杆菌标准株、8种非分枝杆菌标准株、37株分枝杆菌临床分离株.结果 分枝杆菌与非分枝杆菌标准株经PCR扩增后,分枝杆菌标准株均扩增出360 bpDNA片段,非分枝杆菌除甲型溶血性链球菌和假白喉棒状杆菌出现同样片段外,其它菌种均未见扩增.敏感性试验可检测出1 pg结核分枝杆菌DNA.探针特异性试验表明,21种寡核苷酸探针除海分枝杆菌与偶然分枝杆菌的探针有交叉杂交,其余均为特异性杂交.应用该方法对37株分枝杆菌临床分离株进行鉴定,结果与常规方法鉴定结果相符.结论 应用rpoB基因序列和PCR反向斑点杂交技术鉴定分枝杆菌菌种快速、准确,具有较高的应有价值.
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HPV亚型在预防宫颈病变中的检测分析
目的:为HPV检测在预防宫颈癌防治中的重要意义提供理论依据.方法:通过HPV-DNA检测法对576例宫颈癌患者宫颈细胞进行HPV亚型检测.结果:宫颈癌患者中大部分HPV感染,高危各亚型排序为16、58、18、52、59、68、31和CP8304型.宫颈病变Ⅰ～Ⅱ期与Ⅲ～Ⅳ期之间及病变细胞分化程度之间,HPV差异无显著性(P＞0.05).结论:宫颈癌患者中有相当的比例感染HPV,加强HPV检查对有效降低宫颈癌的发生率及死亡率有重要意义.
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利用光波导模式光谱生物传感器研究二级结构对固-液界面DNA杂交动力学的影响
目的 探讨探针和靶分子二级结构对基因芯片杂交过程的影响,并完善基因芯片设计方法,提高基因芯片的重复性和特异性.方法 应用二级结构分析软件Mfold设计3对25-mer完全互补的具有不同二级结构的探针和靶分子(P0T0、P3T3、P4T4)及1对尾端有2个碱基错配的探针和靶分子(P4T3).制备醛基化传感器芯片,将终浓度为1、2、5、10、20 μmol/L的探针分别固定在芯片上,与浓度为5μmol/L的N,N'-对羧苄基吲哚三菁(Cy5)标记靶分子杂交,荧光图像扫描仪检测确定佳杂交探针浓度;以佳探针浓度构建芯片,分别与终浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 μmol/L的Cy5标记靶分子杂交,荧光图像扫描仪检测确定佳杂交靶分子浓度;同时用光波导模式光谱生物传感器(OWLS)实时监测其杂交过程.以0.4% SDS和0.1% NaOH分别处理杂交后芯片10、20、30、60 min,荧光图像扫描仪检测芯片再生稳定性.控制靶分子进样速度和杂交时间分别为15 μl/h、7h和180μl/h、0.5h,OWLS测定杂交复合物质量、杂交效率和反应速率.结果 荧光图像扫描结果显示,佳杂交探针和靶分子浓度分别为10、1 μmol/L,传感器芯片构建成功且具有再生稳定性.15 μl/h、7h和180 μl/h、0.5 h条件下,PoTo、P3T3、P4T4、P4T3杂交复合物的质量(ng/cm2)分别为45和30、43和20、40和13、42和18;杂交效率(%)分别为40.9和27.3、39.1和18.2、36.4和11.8、38.2和16.4;杂交7h时的反应速率常数[K,105 L/(mol·s)]值分别为0.465、0.247、0.081、0.247.结论 在一定时间内,探针和靶分子二级结构增多可导致杂交时间延长,杂交速率和效率降低.应用OWLS成功建立了一种研究固—液界面DNA杂交过程的新平台,为研究基因芯片的杂交过程提供了一个新方法.
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PCR引物浓度对寡核苷酸液相杂交的影响
目的 考察PCR引物浓度配比对液相微珠杂交效率的影响,寻求具有较强杂交信号和较好稳定性的PCR引物浓度配比.方法 建立HLA-DRBl等位基因的相关数据库,选择在HLA-DRBI位点的第二外显子上设计探针,并且选择其保守序列作为阳性对照探针(DPC2),DPC2探针中间位点T突变成A作为阴性对照探针(DNC).分别针对标本C2-008、C2-024、C2-025的等位基因序列设计出6条约21bp的寡核苷酸探针,各探针5'端用氨基(NH2)修饰.通过引物浓度梯度配比(1:100、1:50、1:20、1:8、1:4、1:2、1:1),对型别已知的细胞株DNA进行PCR扩增并得到目的 片段(1:100配比除外),在相同条件下将PCR产物与寡核苷酸探针进行液相杂交检测.结果 浓度配比为1:1的对称式扩增产物杂交结果不理想,而浓度配比分别为1:20、1:8、1:4、1:2的不对称扩增均得到了待检单链、双链DNA混合物,其中1:4浓度配比具有好的扩增效率和稳定性.根据阳性信号与阳性标本是否相符表明:引物浓度配比为1:100的不对称PCR和1:1的对称PCR检测效果差,易出现假阴性;1:2、1:4、1:8、1:20配比检测效果较好,比较稳定.结论 PCR引物浓度配比影响液相微珠杂交效率,不对称PCR产物有利于提高杂交效率,为快速成功配制PCR试剂奠定了基础,有利于寡核苷酸液相芯片的应用.
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室管膜瘤染色体DNA失衡的比较基因组杂交研究
目的 探讨室管膜瘤基因组DNA失衡与其组织学类型、分级和部位及患者性别和年龄的关系.方法 用比较基因组杂交检测了16例室管膜瘤的染色体基因组DNA获得和丢失.结果 16例室管膜瘤的基因组DNA获得和丢失检出率分别为15/16和13/16,共发现24个有DNA获得和19个有DNA丢失的染色体区带.黏液乳头状型(WHO Ⅰ级)的获得和丢失区带数均多,而富于细胞型(WHOⅡ级)和伸长细胞型(WHOⅡ级)的这些异常均多于间变性室管膜瘤(WHOⅢ级).部分获得和丢失区带仅见于黏液乳头状型、富于细胞型、伸长细胞型和间变性中的一种类型,使这些室管膜瘤亚型呈现特征性基因组DNA失衡谱.黏液乳头状型、富于细胞型和伸长细胞型均常出现+7;前两者均有+5,后两者均有-22q;间变性组中+1q 常见,但无其他亚型常见的+5、+7、-4q、-19q和-22q.任何获得和丢失区带的检出率均无性别差异(P>0.05);≤30岁组和颅内组均以+1q和+7p常见,>30岁组和脊髓组均以+7常见,≤30岁组与>30岁组及颅内组与脊髓组比较,三者的检出率差异均有统计学意义(P<0.05).结论 室管膜瘤的基因组DNA失衡频率随其级别升高而相应减少,以上各亚型的特征性基因组DNA失衡谱是决定它们组织学表型和级别的分子遗传学基础,+1q、+5、+7p、+7、-4q、-19q和-22q是评价其生物学行为和患者预后的重要分子遗传学标志.
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脑节细胞性胶质瘤的分子遗传学研究
目的通过研究脑节细胞性胶质瘤全基因组的遗传学改变,探讨该肿瘤的发病机制.方法应用比较基因组杂交技术,分析脑节细胞性胶质瘤全基因组的遗传学改变.结果收集脑节细胞性胶质瘤5例,男性3例,女性2例.其中,3例肿瘤发现有9号染色体短臂(9p)的丢失,2例有7 号染色体的获得,该结果通过荧光原位杂交(FISH)技术得到了进一步的证实.应用免疫组织化学(ABC法)染色,位于染色体7p11-p13上的癌基因表皮生长因子受体(EGFR)在所有5例节细胞性胶质瘤中都无异常表达.此外,在染色体2q33-q34,8q12-q22,14q21-qter,15q26-qter和Y上也都发现了遗传物质的丢失或扩增.结论染色体9p的丢失及7号染色体的获得可能与脑节细胞性胶质瘤的发病机制有关.
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利用比较基因组杂交技术分析食管癌组织中染色体基因组的变化特征
目的探讨河南食管癌高发区居民食管癌发生发展的基因组变化特征.方法应用比较基因组杂交技术分析52例原发性食管癌患者染色体基因组变化,按临床分期、有无淋巴结及远处转移进行分组比较.结果在食管癌中3q、8q、5p、1q、6q、18p、20q的染色体基因组扩增和3p、1p、9q、19p、4p、8p染色体基因组丢失频繁 (>20%).3q、5p、1q、11q13-14的染色体基因组扩增和4pq、13q染色体基因组丢失与食管癌病理分期相关(P<0.05).8q扩增和4p丢失与淋巴结转移相关(P<0.05).2p扩增和4pq、l1q14-qter 的丢失与远处器官转移相关(P<0.05).结论染色体3q、8q、5p、1q、6q、18p和20q部位可能存在与食管癌变密切相关的癌基因,3p、1p、9q、19p、4p和8p可能存在与食管癌变密切相关的抑癌基因;3q、5p、1q、11q13-14扩增和4pq、13q丢失与食管癌的发展相关,而8q、2p扩增和4pq、11q14-qter的丢失是食管癌发展的晚期事件与食管癌转移相关,不同的基因参与了淋巴结转移和远处器官转移.
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山东地区HBV基因型分布及拉米夫定抗病毒治疗对基因分型的影响
目的 确定乙型肝炎病毒(HBV)基因型在山东地区的分布及拉米夫定抗病毒疗效的影响.方法 采用PCR微板核酸分子杂交酶联显色技术,对临床服用拉米夫定一年的131例乙型肝炎患者血清中的HBV-DNA进行基因分型,与未服用拉米夫定组对照.结果 治疗组C型为87.4%(90/103),D型为12.6%(13/103).对照组C型为89.3%(25/28),D型为10.7%(3/28),两组间差异无统计学意义.均未发现A、B、E和F基因型.结论 首次从临床慢性乙肝患者中得出山东地区HBV优势基因型为C基因型,同时存在D基因型.服用拉米夫定治疗一年对HBV基因型没有影响.
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膜芯片技术检测泌尿生殖道沙眼衣原体、淋病奈瑟菌和3种支原体的方法学研究
目的 建立和评价一个新的多重PCR-反向线点杂交技术(RLB)快速同时检测泌尿生殖道沙眼衣原体(Ct)、淋病奈瑟菌(Ng)和3种支原体感染的方法.方法 分别选择Ct隐蔽质粒和Ng 16S rRNA基因设计两对特异性引物,以支原体内转录间隔序列(ITS)设计一对支原体属通用引物,生物素标记下游引物.构建三重PCR同时扩增Ct、Ng、解脲脲原体(Uu)、微小脲原体(Up)、人型支原体(Mh)等菌DNA,然后与固定在尼龙膜上的各特异性寡核苷酸探针杂交.并对142份经荧光定量PCR(FQ-PCR)检测Ct和Ng的性病高危人群标本,以及45份经支原体液体培养法鉴定的标本进行检测.结果 多重PCR可同时扩增Ct、Ng、Uu、Up和Mh标准菌株DNA,其PCR产物的片段长度为208～408 bp.97份FQ-PCR Ct阳性标本中有93份经多重PCR-RLB检测为Ct阳性,45份FQ-PCR Ct阴性标本中35份多重PCR-RLB阴性.41份FQ-PCR Ng阳性标本中34份多重PCR-RLB Ng阳性,101份FQ-PCR Ng阴性标本中98份多重PCR-RLB阴性.其中36份经多重PCR-RLB检测为混合感染.32份支原体液体培养阳性标本中28份多重PCR-RLB阳性,13份支原体培养阴性标本经多重PCR-RLB检测均为阴性.结论 多重PCR-RLB可快速同时检测Ct、Ng、Uu、Up和Mh,为性传播疾病的临床诊断提供了一种可靠的方法.
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采用PCR微板核酸杂交-ELISA技术进行HBV DNA基因分型的研究
目的采用PCR微板核酸杂交-ELISA技术对HBV DNA进行基因分型研究。方法采用PCR、核酸杂交和酶联显色技术，首先将HBV DNA进行PCR扩增，并将扩增产物加入预先包被HBV通用探针的微孔板，再加入HBV各基因型显色探针，同时进行微板核酸夹心杂交-ELISA显色，对152例临床诊断为不同程度乙型肝炎患者血清中的HBV DNA进行基因分型。结果 152例不同临床表现的肝炎患者血清中的HBV DNA的基因型大多集中在B、C和D这3种基因型，其所占比例分别为：B型28.29%（43/152）、C型37.50%（57/152）、D型18.42%（28/152）；A型、E型、F型所占比例很少，各只有3.29%（5/152）。还存在一定比例的混合基因型，B、C、D三型不同组合的混合型共占10.53%(16/152)。结论 PCR微板核酸杂交-ELISA方法可以准确、快速、简便进行HBV基因分型，在探讨HBV的流行病学及观察各基因型毒力强弱及致病性大小方面有重要意义。
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超声诊断胎儿侧脑室扩张合并畸形及其与染色体异常的关系
目的 探讨胎儿侧脑室扩张合并畸形及其与染色体异常的关系,为临床咨询提供参考.资料与方法 回顾性分析150例经超声诊断为侧脑室扩张胎儿的超声图像、染色体核型分析及高分辨微阵列比较基因组杂交技术(aCGH)结果.结果 150例侧脑室扩张胎儿中,孤立性侧脑室扩张81例,合并胎儿超声软指标30例,合并其他中枢神经系统畸形22例,合并其他畸形17例.以上4组染色体核型分析中,异常核型13例,aCGH异常15例.各组染色体异常及aCGH检出率差异有统计学意义(P＜0.05),其中超声软指标组染色体及aCGH异常率显著高于单纯性侧脑室扩张组(P＜0.05),其余各组两两比较差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 产前超声发现侧脑室扩张应仔细检查胎儿各系统.合并胎儿超声软指标或其他结构畸形时,染色体异常的几率明显增加;孤立性侧脑室扩张也需排除染色体异常并定期超声随访.
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儿童急性淋巴细胞白血病差异表达基因文库的构建和筛选
目的克隆和分离儿童急性淋巴细胞白血病（ ALL）差异表达基因，探讨小儿白血病的发病机制。方法 Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞，抽取mRNA，逆转录成cDNA；经RsaⅠ酶切，实验组cD-NA被分成两组，分别与两种不同的接头连接后，与对照组cDNA进行两次消减杂交和两次抑制性聚合酶链反应（ PCR），提取、纯化PCR产物，与PT-Adv载体连接构建cDNA消减文库，利用PCR扩增、测序和同源性分析差异表达的序列。结果选取文库中60个克隆进行菌落PCR分析，可以检出大小为200～600 bp的插入片段。从中随机挑选20个克隆进行测序、生物信息学分析，其中18个克隆与已知基因有高度序列同源性，符合率为98％～100％，共编码17种基因。这些基因大多涉及基因表达调控、DNA损伤修复、细胞周期、物质代谢等，均与细胞增殖、分化有关。此外发现2个新基因。结论本实验表明我们已成功构建小儿ALL相关消减cDNA文库，为小儿ALL发病机制的研究奠定了基础。
关键词： 前体细胞淋巴母细胞白血病淋巴瘤 核酸杂交 基因文库 -
基于实时荧光PCR的探针熔解曲线分析技术和反向点杂交技术应用于β-地中海贫血基因诊断与产前诊断的对比研究
目的 评价基于实时荧光PCR的探针熔解曲线分析(PMCA)技术作为β-地中海贫血(β-地贫)基因诊断和产前诊断方法的可行性.方法 收集2008至2010年在珠海市妇幼保健院经过血液学表型筛查初步诊断为轻型β-地贫的血标本119份、重型β-地贫血标本4份和正常血标本12份.此外,收集严重类型β-地贫高风险孕妇的羊水标本44份和脐带血标本8份.采用双盲法,采用PMCA技术和反向点杂交(RDB)技术对上述187份临床标本分别进行β-地贫基因突变检测,并以DNA测序技术作为金标准,对上述两种方法检测β-地贫基因突变的检测性能进行评估.结果 探针熔解曲线分析法除了漏检1例Ini( ATG＞ AGG)/N和1例不能区分为CD43(G ＞T)/N还是CD37(G ＞A)/(N-)外,其余的185份标本的β-地贫基因型均能正确检出；而RDB法有1例CD71-72(+T)/N未正确检出.以DNA测序技术作为金标准,探针熔解曲线分析法检测的敏感度、特异度、阴性预测值、阳性预测值和诊断效率分别为98.75％、100.00％、93.10％、100.00％、98.93％,RDB法分别为99.38％,100.00％、96.42％、100.00％、99.47％；两者间诊断效率的差异无统计学意义(P =0.999).且产前诊断的结果与胎儿出生或引产后血样的基因诊断或产后随访结果完全一致.结论 PMCA技术可作为RDB技术检测中国人群β-地贫基因突变的替代或验证方法.
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多色探针熔解曲线技术在β地中海贫血产前基因诊断中的应用
目的：建立一种采用多色探针熔解曲线（ MMCA）技术对β地中海贫血进行产前基因诊断的方法。方法方法学建立。收集2014年1至12月在深圳市妇幼保健院产前诊断中心行地中海贫血产前基因诊断的胎儿样本95份，其中孕10～13周绒毛样本9份，孕18～24周羊水样本86份。按双盲对照试验，对上述样本分别采用反向斑点杂交（ RDB）技术和MMCA技术进行β珠蛋白基因突变检测。比较两种方法的一致性。结果93份胎儿样本的MMCA检测结果和RDB检测结果完全一致；2份胎儿样本的MMCA检测经校正后和RDB检测结果完全一致，终95份样本的MMCA检测结果和RDB检测结果完全一致，符合率100％。结论 MMCA技术可应用于β地贫的产前基因诊断，作为RDB技术的有效补充。（中华检验医学杂志，2016，39：192-196）
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液相杂交技术在聚合酶链反应酶联免疫检测的应用
目的采用液相杂交技术，简化核酸杂交过程，建立乙肝病毒（HBV）的液相杂交的聚合酶链反应-酶联免疫检测（PCR-ELISA）方法。方法将5′端标记生物素的PCR扩增产物与5′端标记地高辛的探针呈液相混合，90℃ 2 min，55℃ 1 min杂交。杂交后产物被链霉亲和素酶标板固定，经酶标记抗地高辛标记抗体结合、显色。结果液相杂交酶联免疫检测条件优化：探针浓度3 pmol/次, 酶标记抗体稀释度1∶1000。液相杂交时间3 min，固相杂交时间120 min，但其检测结果无明显差别。检测灵敏度1×104拷贝/ml, 34份HBsAg(+)，HBeAg(+)，抗HBc(+)标本的阳性检出率为97.1%;34份HBsAg(+)，抗HBe(+)，抗HBc(+)标本的阳性检出率67.7% ；17份HBsAg(+)、抗HBc(+)阳性检出率58.8%；其他免疫检测指标组合标本为34份(5.9%)；34份献血员标本均为阴性。结论在PCR-ELISA中使用液相杂交技术可使实验操作简便、快速，更适合临床实验室实际应用。
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结核分枝杆菌耐利福平和异烟肼相关基因快速检测的应用研究
目的 利用DNA芯片检测技术直接检测痰标本中结核分枝杆菌耐利福平(RFP)、异烟肼(INH)相关的耐药基因(rpoB、katG/inhA),评价DNA芯片检测技术临床应用的可行性.方法 对586份涂阳痰标本使用L-J培养并用终点法确定其耐药性,同时利用DNA芯片检测技术检测痰标觋本中结核分枝杆菌的rpoB、katG/inhA常见基因突变位点的突变情况,比对两种方法的检测结果,对不符合的菌株测定其相应DNA序列,评估上述试验的准确性.结果 (1)586份涂阳痰标本,其中3(+)163份、2(+)204份、1(+)217份,培养阳性584份.耐药结果显示,对INH、RFP敏感的菌株分别为361株和327株,耐药菌株分别为223株和247株,其中低浓度耐药、高浓度敏感菌株分别为93株和59株,低浓度、高浓度均耐药菌株分别为130株和188株.(2)耐药基因特异性片段扩增阳性标本367份(62.8%)、阴性217份(37.2%).对INH耐药相关基因(katG/inhA)突变检出率是28.4%,突发发生位点集中在katG315位密码子(89.8%);对RFP耐药相关基因(rpoB)突变检出率是55.9%(137/247),突变发生位点主要在rpoB 531和rpoB 526位密码子,发生率分别是68.6%和16.1%.(3)对L-J药敏结果与DNA芯片检测结果不符的菌株进行DNA序列分析,发现有漏检现象.结论 DNA芯片技术直接检测样本中结核分枝杆菌的相关耐药基因存在可行性,如直接应用于临床样本检测,关键要解决样本中DNA的提取效率、PCR的扩增效率和试验的质量控制.
