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PCR-反向点杂交技术在女性下生殖道人乳头瘤病毒感染分型检测的应用研究
目的 探讨PCR-反向点杂交分型技术在临床人乳头瘤病毒(HPV)感染基因分型中的应用.方法 采用PCR-反向点杂交分型技术,对1 702例女性进行下生殖道23种HPV亚型感染筛查.结果 HPV总感染率为17.6%(300/1 702),有21种型别被检出,感染率高的为低危HPV43型(3.82%),其他型别分别为HPV16(3.70%)、52(2.70%)、6(2.47%)、58(1.88%)、18(1.76%)、56(1.53%)、68(1.29%)、11(0.88%)、33(0.82%)、66(0.71%)、59(0.59%)、53(0.53%)、42(0.53%)、31(0.35%)、73(0.24%)、51(0.18%)、35(0.18%)、83(0.12%)、45(0.06%)和39(0.06%),高危型感染13.9%(237/1 702),低危型感染6.4%(109/1 702),多型感染3.5%(59/1 702);1 702例HPV感染高峰年龄为大于或等于50岁(29.41%),各年龄段HPV感染检出率差异有统计学意义(P<0.05).结论 PCR-反向杂交分型技术能够同时检测高危和低危HPV,可判断多型感染,在临床诊断和普查方面均有重要意义.
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太原地区HPV感染基因型分布与不同年龄段的相关性研究
目的 分析太原地区不同年龄段妇女人乳头瘤病毒(HPV)感染状况及基因型分布特点.方法 利用导流杂交基因芯片技术,对901例妇女阴道分泌物进行HPV分型检测,并对检测结果进行相关性分析.结果 901例标本中HPV阳性检出率为41.73%,其中单一感染、2型感染、多型感染的感染率分别为67.55%、21.28%、11.17%.HPV感染者中检出率较高的亚型为16型(10.54%)、6型(6.33%)、11型(5.44%)、52型(5.22%)和58型(4.33%);16～24岁、25～34岁、35～44岁、45～54岁、≥55岁各年龄段人群中HPV感染率分别57.43% 、42.60% 、35.45% 、31.25% 、51.56%,差异有统计学意义(χ2=31.94,P<0.05).结论 太原地区HPV感染以单一感染为主,与年龄分布具有相关性.
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DNA 微阵列芯片法用于检测结核分枝杆菌耐药性的研究
目的：通过与传统的比例法在结核分枝杆菌耐药性检测的比较，评价 DNA 微阵列法用于检测结核分枝杆菌耐药性的可行性。方法随机抽取本院2012年1月至2013年3月从临床标本中分离培养所得的结核分枝杆菌54株，通过 DNA 微阵列法和比例法分别进行异烟肼和利福平的耐药性检测并对结果进行比较分析。结果以比例法为金标准，DNA 微阵列法对异烟肼和利福平的耐药检测结果与比例法的符合率分别为75．0％、91．0％。结论 DNA 微阵列技术适用于临床一线耐药结核分枝杆菌的快速筛查。
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多重PCR和反向线点杂交技术快速检测鲍曼不动杆菌21个主动外排基因及临床应用
目的 建立一种新的多重PCR和反向线点杂交技术(mPCR-RLB)快速同时检测鲍曼不动杆菌21个主动外排基因的方法并评价其临床应用价值.方法 根据GenBank中收录的多重耐药鲍曼不动杆菌AYE株5个外排泵蛋白基因家族,选取其中21个基因(4个来自MFS家族,13个来自RND家族,2个来自MATE家族,1个来自SMR家族,1个来自ABC家族).设计22对引物及寡核苷酸探针(1对鲍曼不动杆菌通用引物及探针),mPCR同时扩增22个目的 基因,PCR产物再与固定在尼龙膜上的特异性寡核苷酸探针反向线点杂交,同时检测上述22个基因.用该法对40株经过鉴定的鲍曼不动杆菌进行检测.结果 除cmlA5和cmlA基因未检出阳性外,其余19个外排泵基因均呈阳性.除第16号菌株外排泵基因检测阴性外,其余39株鲍曼不动杆菌临床株携带外排泵基因数量从5～18个不等.外排系统在多重耐药菌株及相对敏感菌株中均有分布.11个外排泵基因在多重耐药鲍曼不动杆菌菌株中阳性率明显高于敏感株,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 建立的mPCR-RLB技术可快速同时检测鲍曼不动杆菌多个外排泵基因,短时间内明确菌株携带外排泵基因情况,对明确其多重耐药性的发生机制、避免药物成为外排泵对象、找到更有效的特异外排系统抑制剂均有重要意义.
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不同方法对外阴阴道假丝酵母菌病的检出效果
目的 探讨湿片镜检 、革兰染色镜检 、阴道炎干化学五联检 、阴道炎抗原三联检 、核酸杂交和真菌培养等方法对阴道分泌物标本中外阴阴道假丝酵母菌(即念珠菌)的检出效果.方法 同时使用上述方法检测211例阴道分泌物标本,并以真菌培养法为金标准对数据进行统计分析.结果 湿片镜检 、革兰染色镜检 、阴道炎干化学五联检 、阴道炎抗原三联检及核酸杂交法检测外阴阴道假丝酵母菌(即念珠菌)的灵敏度分别为43.48％ 、58.70％ 、63.04％ 、34.78％ 和71.74％,特异度分别为98.79％ 、98.18％ 、79.39％ 、96.36％ 和98.79％,诊断符合率分别为86.73％ 、89.57％ 、75.83％ 、82.94％ 和92.89％;5种方法分别与真菌培养法比较,Kappa值(一致性检验)分别为0.521、0.650、0.374、0.384和0.772;相对于真菌培养法,曲线下面积(AUC)分别为0.711、0.784、0.712、0.656和0.853,核酸杂交法AUC值大,阴道炎抗原三联检AUC值小;5种方法总符合率为60.66％.结论 5种方法中,核酸杂交法对念珠菌的检出效果佳,革兰染色镜检法和湿片镜检法次之,阴道炎干化学五联检 、阴道炎抗原三联检效果很不理想,不建议单独使用;5种方法间总体符合率非常低,不建议不同实验室和不同方法间进行比较.
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东莞地区乙型肝炎患者HBV基因分型研究
目的 检测分析东莞地区乙型肝炎(下称乙肝)患者乙型肝炎病毒(HBV)基因型分布及其与性别、HBV血清标志物和HBV DNA定量值的关系.方法 用聚合酶链反应(PCR)-微板核酸杂交-酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测6种HBV基因型,ELISA法检测血清HBV标志物(两对半),荧光定量-聚合酶链反应(FQ-PCR)法检测血清HBV DNA定量值,并对结果进行分析.结果 东莞地区206例乙肝患者HBV基因型分布:C型为主69.42%(143/206)、B型11.17%(23/206)、D型7.28%(15/206) 、B+C混合型5.83%(12/206)、C+D混合型5.34%(11/206)、B+D混合型0.97%(2/206).基因型男、女性别检出率比较差异无统计学意义(P＞0.05).基因型C与其它各基因型检出率比较差异有统计学意义(P＜0.01).各基因型阳性组血清平均HBV DNA定量值大于1×106 (copy/ml),各基因型阳性组与基因型阴性组血清平均HBV DNA定量值比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论 东莞地区乙肝患者HBV基因型分布以C型为主.基因型阳性检出率从高到低依次为 C、B、D、混合型(B+C型、C+D型、B+D型).HBV基因型检出率与性别关系不明显,与HBV血清标志物和HBV DNA定量值有一定关系.东莞地区HBV基因型分布状况可能与本地区外来人群相关.
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乙型肝炎病毒D基因型与原发性肝癌的关系
根据HBV全基因序列的同源性差异≥8%,现已将HBV分为A～G 8个基因型[1].HBV DNA的基因型别呈一定的地域性分布,不同的基因型与HBV感染途经、致病性亦有一定的相关性[2].在我国约有90%原发性肝癌(HCC)合并HBV感染,HBV感染与HCC的发生密切相关.然而,迄今为止对HBV感染后的确切致癌机制还不甚清楚,有关HBV基因型与HCC关系的研究甚少.应用P CR微板核酸杂交酶联免疫吸附试验(ELISA)对73例HBV DNA阳性HCC患者进行了基因分型,旨在探讨HBV基因型与HCC的关系.
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乙型肝炎病毒基因型分布及临床意义
乙型肝炎病毒(HBV)基因型呈一定的地理区域性分布,但是由于分析的标本有限,其结果并不完全一致.各地区优势基因型不同,故预后也不相同[1].因此,本研究应用聚合酶链反应(PCR)微板核酸杂交-酶联免疫吸附(ELISA)技术[2],调查了新疆地区HBV基因型的分布及其临床意义.
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深圳地区乙型肝炎病毒DNA基因分型与临床的关系
目的检测血清中乙型肝炎病毒(HBV)DNA并进行基因分型.方法采用聚合酶链反应(PCR)扩增HBV DNA后,用不同的探针,利用微板杂交法将其分为6个亚型.结果150例HBV DNA阳性病人中,B型50例、C型36例、D型1 3例、F型3例和A型1例,没有发现E型.另有47例为混合型,其中以B、D型(1 8例)、C、D型(20例)为主,分别占混合型的3 8.30%与42.6%.受检病人中,B型感染者丙氨酸氨基转移酶水平明显增高;B型感染者比C型感染者抗-HBe阳性率高,分别为64.0%和30.5%,而C型感染者比B型感染者乙型肝炎e抗原阳性率高,分别为4 7.2%和2 2.0%;年龄、性别与基因型关系不明显.结论深圳地区H B V基因亚型以B型为主,C型次之,其他较少.基因型与肝炎程度有一定关系.
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靶DNA长度对压电传感器基因杂交效应的影响
目的:探讨靶DNA长度对压电传感器基因杂交效应的影响.方法在压电传感器阵列上固定20碱基的巯基DNA序列作为探针后分别与不同长度的含互补片段的靶序列进行杂交,计算机采集并分析传感器频率数据,比较各靶DNA长度下杂交达到平衡所需时间,杂交前后频率差,并计算杂交动力学参数.结果随靶DNA长度增加,杂交时间有延长趋势.在靶DNA长度为20～108个碱基时,其频率变化值与碱基数呈线性关系,而225、379、654个碱基时的频率变化反应则明显降低.结合常数变化不明显,而解离常数呈增大趋势变化,使平衡常数逐渐减小.结论在石英晶体传感器阵列上,频率变化值随靶序列长度增长而增大,但反应效率不一样.
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离子强度对压电传感器基因杂交动力学的影响
目的探讨盐离子浓度对压电传感器基因杂交动力学的影响.方法设计并合成金黄色葡萄球菌耐药基因探针及与其完全互补的靶序列,在石英谐振压电传感器阵列上进行杂交,杂交缓冲液中含5种NaCl浓度.计算机采集并分析传感器频率数据得出杂交动力学参数,同时比较各盐离子浓度下杂交达到平衡所需时间,杂交前后的频率差,平衡后频率波动幅度大小.结果随NaCl浓度增加,结合速率常数、杂交平衡常数、大杂交量均呈现明显增大趋势,而离解速率常数呈下降趋势,杂交前与杂交平衡后的频率差值增大,同时,杂交平衡后频率波动幅度相应、增大,杂交达平衡所需时间延长.结论一定的盐离子浓度促进基因杂交,但盐离子浓度过高则对晶体振荡性能产生负面影响.
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探针浓度对压电传感器基因杂交效应的影响
目的探讨探针浓度对压电传感器基因杂交效应的影响.方法9种浓度的探针与同一浓度的靶序列在压电传感器阵列上进行杂交,计算机采集并分析传感器频率数据,比较各探针浓度下固定前后频率差、杂交达到平衡所需时间,杂交前后频率差,同时,根据较低浓度数据得出的杂交动力学参数,计算各浓度下的频率变化理论值.结果随探针浓度增加,固定引起的频率变化值逐渐增加;杂交时间有缩短趋势;杂交前后的频率差值在探针浓度较低(1 nmol/L～0.5 μmol/L)时逐渐增大,而探针浓度较高(1.0～3.5 μmol/L)时反而减小.高浓度时杂交前后频率变化理论值与实际值存在明显差异.结论在石英晶体传感器阵列上,基因杂交效率随探针浓度增加而增大,但探针浓度过高反而抑制杂交,其原因可能主要在于探针之间的空间构象关系和静电排斥.
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应用微阵列比较基因组杂交技术产前检测室间隔缺损胎儿2p16.3微缺失的临床研究
目的 了解心脏室间隔缺损胎儿基因组拷贝数变化,寻找其致病的遗传学基础,探讨微阵列基因组杂交技术在产前诊断中应用的可行性.方法 用G显带核型分析技术分析胎儿及其父母外周血染色体,用微阵列比较基因组杂交技术(ArrayCGH)进行患儿及其父母DNA拷贝数变异分析,经数据库比对和文献分析明确异常缺失区域的病理意义.结果 患儿父母外周血染色体核型分析未见异常;Array-CGH检测患儿发现染色体2p16.3区存在640×103 bp的缺失,15qll区存在2 028×103 bp的缺失,20p13区存在535×103 bp的重复.结论 经查数据库及相关文献发现染色体2p16.3区域微缺失可能与胎儿室间隔缺损相关.
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2种不同类型的核酸探针对压电基因传感器阵列检测特异性的影响
目的探讨用PNA作为探针与普通的DNA探针相比对压电传感器基因杂交的优越性.方法用生物素-亲和素法分别将PNA、DNA两种探针固定在基因传感器的金膜表面,分别与完全匹配、1个碱基错配、2个碱基错配的互补靶序列进行杂交,观察2种不同的探针与靶序列反应所引起的频率变化及所用的时间.结果相对于DNA探针,PNA探针识别碱基错配的能力明显高,且杂交时间更短.结论 PNA与靶序列DNA结合有高度的特异性,选用PNA作探针,可提高压电基因传感器检测的特异性.
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生物芯片技术在性传播疾病病原体研究中的应用
生物芯片技术又称之为基因芯片技术、 DNA芯片技术,是 20世纪 90年代初半导体技术和生物技术"联姻"的结晶.传染性疾病是当今威胁人类健康的大敌之一,其中性传播疾病( STD)的病原体种类繁多,混合感染较常见,目前临床还缺乏特异、敏感的同时检测多种病原体的方法,因此生物芯片技术利用核酸杂交基本原理,仅单一杂交实验就可实现大量序列平行鉴定,同时迅速、敏感地检测多种基因,在病原体的基因诊断、分型、耐药机制及其它研究中具有广泛的应用前景.现就生物芯片进展及其在 STD病原体研究中的应用作一综述.
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串联重复核酸序列构建及其杂交信号放大作用
采用交错延伸聚合酶链反应技术将含重复单位的DNA片段拼接成4串联重复核酸序列,再用重复克隆方式获得含25串联重复核酸序列的重组载体.通过杂交产物直接凝胶电泳和斑点杂交等方法分析其信号放大作用.经凝胶电泳和限制性内切酶分析证实,24串联重复核酸序列构建成功,加上插入噬菌粒原有的1个重复单位,使整个重组载体含25个串联重复.凝胶电泳分析显示,串联重复核酸序列可与多个次级探针结合.斑点杂交分析显示,串联重复核酸序列可使信号放大,将检测的敏感性提高约16倍.串联重复核酸序列具有较好的信号放大作用,克隆化后又有利于大量制备和降低成本,因而串联重复核酸探针在医学临床检测和实验研究中具有广泛的应用前景.
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分别携带β珠蛋白基因CD41-42(—TCTT)和CD43(G→T)突变夫妇的产前诊断结果分析
目的 为两对双方分别携带β珠蛋白基因CD41-42(—TCTT)和CD43(G→T)杂合突变的夫妇提供产前诊断,明确其胎儿的基因型.方法 应用反向斑点杂交法(两种试剂盒)、多色探针熔解曲线法和DNA序列分析法同时检测β珠蛋白基因的突变.结果 家系1胎儿3种方法的检测结果均显示其为CD43(G→T)突变杂合子;家系2胎儿多色探针熔解曲线结果和DNA序列分析结果均提示为CD41-42(—TCTT)和CD43(G→T)突变双重杂合子,而反向斑点杂交法两种试剂盒产生了不一致的结果,一种为CD41-42(—TCTT)和CD43(G→T)突变双重杂合子,而另一种为CD41-42(—TCTT)突变纯合子.结论 对携带β珠蛋白基因CD41-42(—TCTT)和CD43(G→T)突变的夫妇进行产前诊断应采用其他可避免误诊的手段,如直接测序等.
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现代生物技术在分子微生物生态学中的应用
微生物生态学研究中采用的分子生物学方法主要有标记核酸探针技术、基于PCR的分析方法、梯度凝胶电泳方法、磷脂脂肪酸谱图分析方法、rRNA序列同源性分析方法以及质粒、编码特殊蛋白质和低分子量RNA基因分析等.这些技术方法的采用在微生物生态学研究中取得了重大的突破,使得对某些微生物的研究成为可能,并在分子水平上阐述了其生态机制.
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聚合酶链反应-反向线点杂交技术鉴定分枝杆菌的多中心评价
目的 评价以16S-23S rDNA间隔序列作为靶基因的聚合酶链反应-反向线点杂交(PCR-RLB)技术用于鉴定分枝杆菌.方法 在5个中心同时进行试验.采用PCR-RLB技术检测60株属于50个种的分枝杆菌标准株;10株非分枝杆菌标准株.以胶体金法结合测序法或是气相色谱(gas chromatography,GC)法作为对比,检测鉴定383株分枝杆菌临床分离株.结果 所有的分枝杆菌标准株和临床分离株PCR扩增产物均可与分枝杆菌属探针杂交, 而种特异性探针仅与相应的种杂交,非分枝杆菌PCR扩增产物均不与分枝杆菌属及种探针杂交.与胶体金法或是GC法结合测序法相比,PCR-RLB法准确率100%,成功地将380株分枝杆菌鉴定到种(另外3株仅鉴定到分枝杆菌层未鉴定到种),包括11株其他方法不能准确鉴定的混合感染.结论 以16S-23S rDNA间隔序列作为靶基因的PCR-RLB技术,鉴定分枝杆菌敏感性和特异性高,快速、实用,具有很好的临床应用前景.
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血清HBeAg阴性HBV感染者病毒含量与基因突变的临床关系
目的:了解HBV感染者血清HBeAg阴转后HBV DNA含量与C基因启动子(basal core promoter,BCP)和C基因(pre-core/core,preC/C)变异的关系.方法:采用PCR微板核酸杂交方法检测342例血清HBeAg阴性HBV感染者血清HBV DNA含量及BCP与preC/C基因变异.结果:在HBsAg/HbcAb/HbeAb和HBsAg/HbcAb感染模式中检测到HBV DNA阳性率为22.8%(36/158)及31.6%(31/98).两者无显著差异(P＞0.05);两种模式中HBV DNA阳性血清的BCP变异检出率分别为;63.9%(23/36)、51.6%(16/31);preC/C变异检出率77.8%(28/36)、58.1%(18/31);HBV DNA血清浓度平均为49.2±36.7pg/ml、51.7±31.5pg/ml,均无显著差异(P＞0.05).两种基因变异间无相关关系(P＞0.05).但BCP变异组HBV DNA(61.8±34.1pg/ml)显著高于非变异组(34.4±29.7pg/ml);preC/C变异组HBV DNA(55.7±31.5pg/ml)显著高于非变异组(38.7±24.1pg/ml).结论:BCP基因变异与preC/C变异是随机存在于HBeAg转换中,突变后血清HBV DNA浓度显著升高.
