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多位点序列分析法在白念珠菌性阴道炎唑类耐药菌株分子流行病学研究中的运用
目的 运用多位点序列分析(MLST)法对白念珠菌性阴道炎患者阴道分离的对唑类抗菌药物耐药的白念珠菌临床菌株进行分子流行病学调查,对比耐药株和敏感株之间的基因型差异,分析其分子流行病学特征并研究耐药株的遗传多样性和种群关系.方法 对上海市嘉定区中心医院2015年7月—2016年6月的白念珠菌性阴道炎患者的白带样本进行真菌培养、鉴定及体外药物敏感性试验,共收集60株对氟康唑、伏立康唑和伊曲康唑中1种或多种药物耐药的菌株;另收集同期对3种药物均敏感的菌株38株.采用MLST法对耐药菌株和敏感菌株进行分析,采用BioNumerics 7.6软件进行亲缘性和聚类分析.结果 耐药菌株组存在14种序列类型(ST),其中9种已报道,主要型别为ST310、ST1364、ST2551和ST135;敏感菌株组存在19种ST,其中12种已报道,主要型别为ST2048和ST1474.耐药菌株组的ST数/菌株数比值低于敏感菌株组,且2个组的ST数与菌株数均呈线性正相关关系(耐药菌株组:r=0.995,P=0.005;敏感菌株组:r=0.989,P=0.011).亲缘性分析显示耐药菌株各基因型间的亲缘性要近于敏感菌株.聚类分析显示耐药菌株的种群形成了多级分支,ST310、ST1364和ST2551同处于第1分支,ST135为第2分支,其主要ST型别之间形成了较为明显的聚类分布.结论 MLST法结果显示上海市嘉定区中心医院临床分离的白念珠菌为多克隆性,唑类药物耐药菌株的基因型分布较敏感菌株更为集中.耐药菌株各基因型间的亲缘性要近于敏感菌株,且其种群分类的基因型呈明显的聚类分布.
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不对称荧光PCR扩增白念珠菌ITS-2基因单链DNA实验
目的 比较在限制性引物不同稀释比例条件下,不对称荧光聚合酶链反应(PCR)扩增白念珠菌5.8S rDNA与28S rDNA间内转录间区2(ITS-2)基因的单链DNA(ssDNA)的实际效果,探讨其体系优化方法.方法 以常规PCR为对照,将20μmol/L的正向引物(P1)按照一定比例预稀释后,分别与20μmol/L的荧光标记反向引物(P2')组成含不同P1水平的引物对,采用不对称荧光PCR扩增真菌ITS-2,并对PCR产物进行电泳和测序分析,比较各实验组扩增ssDNA的效果.结果 不对称荧光PCR成功扩增出白念珠菌ITS-2基因的ssDNA,随着限制性引物水平的降低,ITS-2基因的双链DNA(dsDNA)条带逐渐变淡,而ssDNA条带逐渐变亮;在限制性引物稀释比例达到1:90~1:100时,dsDNA条带已经模糊不清,而ssDNA条带则达到亮.提示在此扩增体系条件下,ssDNA拷贝数多,为不对称荧光PCR扩增白念珠菌ITS-2基因ssDNA的佳扩增条件.PCR产物测序也表明,dsDNA上方的条带为ITS-2基因的ssDNA.结论 通过优化限制性引物水平,不对称荧光PCR可以高效地扩增白念珠菌ITS-2基因的ssDNA.
关键词： 不对称荧光聚合酶链反应 白念珠菌 ITS-2基因 单链DNA -
白念珠菌14-α脱甲基酶 K143Q 氨基酸置换与氟康唑耐药形成的相关性研究
目的：研究临床耐氟康唑白念珠菌14-α脱甲基酶的 K143Q 氨基酸置换与氟康唑耐药形成的关系。方法运用体外定点突变技术构建 ERG11基因 A427C 突变型重组质粒，并利用酶切、连接构建 YES2/CT 酵母表达质粒。通过构建成的表达质粒在酿酒酵母中的异源性表达及体外药物敏感性表型的检测，分析其致 K143Q氨基酸置换与白念珠菌对氟康唑产生耐药的关系。结果真菌体外药物敏感性表型检测显示，含氨基酸置换的表达质粒转染于酿酒酵母 INVSc1后，氟康唑低抑菌浓度（MIC）增加16倍。结论K143Q 可增强白念珠菌对氟康唑的耐药性。
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转录因子Flo8 G723R、T751D突变增强白念珠菌毒力
目的：研究白念珠菌转录因子Flo8 G723R和T751D突变与毒力的关系。方法比较白念珠菌Flo8野生株SN152、Flo8回复株Flo8SN152、Flo8突变株Flo8G723R和Flo8T751D感染小鼠的致死率和肾脏菌量负担，同时检测各菌株毒力因子的基因表达情况，分析Flo8突变与白念珠菌毒力的关系。结果与SN152和Flo8SN152相比，转录因子Flo8突变株Flo8G723R和Flo8T751D感染小鼠的致死率更高、肾脏菌量负担更高，毒力因子的基因表达也有不同程度的增强。结论转录因子Flo8 G723R和T751D突变使白念珠菌毒力增加，部分毒力因子的基因表达增强。
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关注分子技术在临床微生物检验中的应用
本期“微生物分子诊断专题”精心组织了6篇文章，包括1篇综述和5篇专著。内容主要围绕临床常见的细菌、真菌和分枝杆菌感染等的诊断、治疗（耐药）、预防和控制问题，重点介绍了分子生物学技术在临床微生物标本的直接检测、基因分型、耐药基因研究、抗原制备及血清学诊断等方面的应用研究。血流感染是一种严重的全身感染性疾病，但血培养存在检验周期长、阳性率低等问题，应用分子生物学技术能够对血流感染中的常见或少见病原菌、分枝杆菌、苛养菌等进行快速鉴定及耐药分析，可以缩短检验周期。艰难梭菌是一种重要的医院感染病原菌，引起抗菌药物相关性腹泻，GeneXpert实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）能够直接检测粪便标本中的艰难梭菌，具有快速、操作简便等优点。光滑念珠菌可引起血流感染等多种感染，且耐药性强，是医院感染中常见的侵袭性真菌，微卫星多态性分析法简便快速，分辨力高于多位点序列分析（MLST），可作为临床实验室光滑念珠菌基因分型方法。近年来白念珠菌对唑类抗真菌药的耐药性有增高趋势。“白念珠菌对唑类耐药的机制和生物膜相关基因的表达”一文提示ERG11基因的过度表达为白念珠菌对唑类耐药的重要机制。菌丝细胞壁蛋白HWP1基因的高表达与白念珠菌生物膜形成相关。肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类耐药的主要机制是产生质粒介导的2型肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC-2），“同源重组敲除临床肺炎克雷伯菌质粒blaKPC-2基因”一文建立的λred同源重组法能可靠敲除其质粒上的blaKPC-2，为进一步研究blaKPC-2在肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物耐药中所起的作用奠定基础。“结核分枝杆菌rdESA7-6抗原在耻垢分枝杆菌中的制备及其血清学诊断研究”一文研究制备的结核分枝杆菌融合蛋白-6用于结核病血清学检测具有较好的敏感性和特异性，可用于结核病患者的血清学诊断。
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白念珠菌唑类耐药和生物膜相关基因的表达
目的：研究白念珠菌临床分离株唑类耐药和生物膜形成相关基因的表达。方法收集上海市公共卫生临床中心2006至2011年92例感染性疾病患者[病毒性肝炎、结核、获得性免疫缺陷综合征（AIDS）]血液、无菌部位和黏膜分离鉴定的白念珠菌104株，选用ATB FUNGUS3检测抗菌药物（氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑）的低抑菌浓度（MIC），采用半定量逆转录聚合酶链反应（PCR）分析唑类敏感、浓度依赖性敏感（S-DD）和耐药菌株之间药物外排泵基因CDR1、CDR2、MDR1和药物靶酶基因ERG11表达的差异，同时通过甲基四氮盐（XTT）代谢试验筛选强生物膜形成能力菌株（HBFs），研究其与弱生物膜形成能力菌株（LBFs）相关基因ALS3和HWP1表达的差异。结果104株白念珠菌中共检测出16株至少对1种唑类药物耐药，6株至少对1种唑类药物S-DD。药物靶酶基因ERG11在耐药株、S-DD株和敏感菌之间比较，差异有统计学意义（P＝0．0078），且耐药株、S-DD株分别与敏感菌比较，差异有统计学意义（P＜0．05），然而CDR1、CDR2和MDR1表达量在3种菌株间无明显差异。生物膜形成能力试验显示16株菌生物膜形成能力增强，其HWP1表达量与LBFs比较差异有统计学意义（P＝0．0079），ALS3表达量差异无统计学意义。结论 ERG11基因的过度表达为白念珠菌唑类耐药的重要机制。菌丝细胞壁蛋白HWP1基因的高表达与白念珠菌生物膜形成增强相关。
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白念珠菌唑类药物相关耐药基因及其调控机制的研究进展
白念珠菌是人体常见的条件致病性真菌.随着唑类抗真菌药物的长期、广泛应用,白念珠菌耐唑类抗真菌药物的临床分离株也逐渐增多,已经成为临床抗白念珠菌治疗的棘手问题.现就白念珠菌唑类药物相关耐药基因及其调控机制进行综述,以便在转录调控层面寻找新的白念珠菌感染的治疗靶点及开发新的抗真菌药物.
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深部真菌的耐药性及其耐药机制研究
本期“深部真菌的耐药性及耐药机制”专题汇集了4篇论著和1篇综述,阐述了白念珠菌、烟曲霉和新生隐球菌的耐药性及其耐药机制.随着抗真菌药物的大力应用,真菌的耐药性不断上升,研究真菌的耐药机制并探讨新抗真菌药物的作用靶点,可为新抗真菌药物研发和临床抗真菌治疗提供参考依据,这有着重要的临床意义.
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白念珠菌MRR2基因错义突变C1409A与氟康唑耐药的相关性
目的 研究锌簇转录因子——多药耐药调节因子2(Mrr2)编码基因MRR2错义突变C1409A与白念珠菌氟康唑耐药的相关性.方法 利用白念珠菌工程菌株SN 152构建MRR2基因敲除菌株,通过一步法克隆及定点突变技术构建MRR2基因C1409A突变型表达质粒,再用高效醋酸锂转染法将质粒片段转染入MRR2基因敲除菌株,异位表达于ADE2位点以构建MRR2基因定点突变菌株.通过体外药物敏感性试验及实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)分析错义突变C1409A与氟康唑耐药的关系.结果 氟康唑对MRR2基因C1409A定点突变的白念珠菌的低抑菌浓度(MIC)较对工程菌株SN152的MIC增加4倍,CDR1表达上调约3倍.结论 MRR2基因错义突变C 1409A可上调白念珠菌CDR1表达并介导白念珠菌对氟康唑的耐药.
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白念珠菌FLO8基因高表达菌株构建及鉴定
目的:构建白念珠菌FLO8基因高表达菌株.方法:将白念珠菌FLO8基因插入pCP20质粒载体ADH1启动子后,通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)将ADH1-FLO8-LoxP-ARG4-LoxP-ADE2片段扩增,并通过同源重组技术将该片段整合至SN152的ADE2位点.结果:通过测序鉴定FLO8基因高表达质粒载体构建成功;通过同源重组及实时反转录PCR验证表明FLO8基因整合到SN152菌株的ADE2位点并且表达量增高.结论:以pCP20质粒为载体,通过同源重组等技术,可高效构建白念珠菌FLO8基因高表达菌株.
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白念珠菌锌簇转录因子编码基因mrr2敲除与鉴定
目的：构建白念珠菌mrr2基因敲除菌株。方法：通过长引物PCR方法及融合PCR方法，以SN152菌株基因组DNA、带有筛选标记的质粒DNA为模板构建基因敲除组件；再用高效醋酸锂转染法将敲除组件转染入SN152菌株，并在相应营养缺陷的筛选板上培养生长，再通过2次同源重组的策略敲除mrr2的2条等位基因。结果：成功构建白念珠菌mrr2基因敲除菌株。结论：融合PCR策略可高效、快速构建白念珠菌基因敲除菌株。以SN152菌株为亲本菌的mrr2基因敲除株的构建，为进一步研究白念珠菌耐药机制奠定基础。
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白念珠菌临床分离株吡咯类耐药机制研究
目的 分析女性生殖道感染白念珠菌临床分离株对5种抗真菌药物的耐药率,探讨白念珠菌对吡咯类药物的耐药机制.方法 ①收集2015年1-12月自复旦大学附属妇产科医院女性生殖道感染患者中分离的白念珠菌1 646株,统计菌株对5种抗真菌药物的耐药情况.②收集包括该院和上海市另2所妇产科专科医院微生物室临床分离白念珠菌氟康唑耐药菌株30株、剂量依赖性敏感(S-DD)菌株13株、敏感菌株10株.采用实时荧光定量PCR技术分析吡咯类耐药组、S-DD组和敏感组之间药物外排泵相关基因CDR1、CDR2、MDR1和药物靶酶基因ERG11表达水平的差异.同时,PCR扩增ERG11和ERG3基因并测序,分析ERG11和ERG3基因与耐药相关的突变位点.结果 ①1 646株白念珠菌对伊曲康唑耐药率高,为5.2％,对伏立康唑、氟康唑和5-氟胞嘧啶的耐药率分别为3.2％、2.5％和2.1％,所有菌株对两性霉素B均敏感.②S-DD组和耐药组ERG11基因表达较敏感组均显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05);而药物外排泵基因CDR1、CDR2和MDR1表达量在敏感组、S-DD组和耐药组间差异无统计学意义.③检测到ERG11基因存在13个错义突变位点,其中T123I、P98S和Y286D为新发现的3个氨基酸置换位点;且T123I和Y132H同时出现在26株耐药株中,其中16株为吡咯类药物全耐药;此外,2株吡咯类全耐药菌株中检测到ERG3基因杂合突变.结论 外阴阴道念珠菌病患者中分离的白念珠菌对吡咯类药物的耐药率比5-氟胞嘧啶和两性霉素高;ERG11基因突变及其过表达是该病白念珠菌吡咯类耐药的主要分子机制之一.
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多肽bCAT通过下调白念珠菌HWP1基因表达抑制生物被膜的形成机制
目的 明确多肽bCAT抑制白念珠菌生物被膜形成能力,并探索其与黏附基因HWP1表达的关系.方法 标准菌株白念珠菌ATCC10231和临床菌株作为研究对象,XTT法检测其生物被膜形成能力,bCAT抗浮游白念珠菌的MIC值以CLSI-M27-A3方法确定,XTT法及菌落计数检测bCAT抑制生物被膜形成作用,并计算代谢活性确定抑制50％生物被膜形成的MIC (BIC50),bCAT减少白念珠菌的黏附作用经倒置显微镜下观察及菌落计数法检测,并采用RT-PCR通过2-△△Ct法计算HWP1的表达量.统计方法为单因素方差分析,组内比较采用Dunnett T3检验.结果 标准菌株及临床菌株均有较强生物被膜形成能力.bCAT抗浮游状态的白念珠菌MIC值为40～80 μmol/L,BIC50为80～160μmol/L;并且bCAT能减少白念珠菌的黏附作用,空白对照组菌落计数为(27 822.22±2 472.74) cfu,bCAT浓度为160、80、40、20、10 μmol/L时的菌落个数分别为(5 355.55±1 264.03) cfu、(11 377.78±2 232.58) cfu、(17 488.89±1 136.27) cfu、(22 377.78±3 521.99)cfu、(26 044.44±1 329.57) cfu.组间差异具有统计学意义(F=147.018,P=0.001),组内比较发现160、80、40 μmo1/L处理组与不含bCAT时差异具有统计学意义(P＜0.05).RT-PCR发现160 μmol/L处理组HWP1相对表达量为空白对照组的12.24％.结论 bCAT能有效抑制白念珠菌生物被膜形成,其机制可能与降低HWP1基因的表达从而减少白念珠菌的黏附有关.具有一定的临床前景.
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外阴阴道念珠菌病患者耐氟康唑白念珠菌克隆流行分析
目的 探讨上海地区外阴阴道念珠菌病的菌种分布及其主要致病菌的分子流行特点,并进行菌株遗传进化分析.方法 收集2015年8月至2016年2月复旦大学附属妇产科医院、上海市第一妇婴保健院及国际和平妇幼保健院3所医院外阴阴道念珠菌病患者分离得念珠菌共2 1 85株,进行菌种鉴定及统计分析,并采用ATB FUNGUS 3试剂盒检测抗真菌药物体外低抑菌浓度,对其主要致病菌运用多位点序列分型(MLST)的方法进行分子分型,同时应用eBURST和MEGA6.0软件进行遗传进化分析.结果 2 185株念珠菌属中共鉴定出白念珠菌1 988株,光滑念珠菌149株,热带念珠菌20株,其他念珠菌28株;白念珠菌对氟康唑耐药率为6.5％;93株白念珠菌共检测出26个二倍体序列型(DST),其中50株敏感菌序列型为分散分布,而43株耐氟康唑白念珠菌集中于同一个克隆复合体(CC 69),并处于同一个进化树分枝上(Clade 1).结论 白念珠菌是上海地区3所妇产科医院外阴阴道念珠菌病的主要致病菌,对三唑类药物的耐药率较高,而且耐氟康唑白念珠菌表现为CC 69的克隆传播流行,需要进行重点监控.
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致阴道病的白念珠菌多位点序列分型分析及遗传多样性
目的：对上海市3所妇产科医院分离的114株白念珠菌进行分子流行病学研究，分析本地专科医院分离的白念珠菌主要基因型别与菌株耐药关系，并了解菌株间遗传多样性与种群分类关系。方法收集来自复旦大学附属妇产科医院、上海市第一妇幼保健院和国际和平妇幼保健院共114株白念珠菌，采用eBURST进行菌株亲缘性分析，多位点序列分型（MLST）方法进行分型，并采用ATBTM FUNGUS 3试剂盒作真菌体外药物敏感试验。结果114株菌株中共有47种DST型（diploid strain types, DST），其中已知30种，主要组群为DST 79和DST 435。114株白念珠菌对氟胞嘧啶、两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑敏感率分别为96.5%、100%、85.1%、55.2%、84.3%。结论上海地区不同妇产科医院致病性白念珠菌呈多克隆系，但主要为DST 79和DST 435型，且具有一定耐药性。通过应用MLST分型方法，初步发现上海地区白念珠菌具有遗传多样性，且种群分类与基因分型具有相关性。
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上海3所妇产科医院白念珠菌基因同源性分析
目的 了解上海地区白念珠菌主要基因型,为监测和诊治临床白念珠菌感染提供实验依据.方法 收集2013年11月-2014年1月复旦大学附属妇产科医院、国际和平妇幼保健院和上海市第一妇婴保健院3所医院阴道炎患者阴道分泌物分离的白念珠菌共115株,随机扩增多态性DNA检测其基因型,ATB FUNGUS 3试剂盒检测5种抗真菌药物低抑菌浓度.结果 随机扩增多态性DNA结果显示,115株菌分为A、B、C3型,其中A型89株(占77.4％)又分5个亚型,B型22株(占19.1％)分为2个亚型.C型4株(占3.5％).115株白念珠菌对5-氟胞嘧啶敏感率为96.5％;对两性霉素B敏感率为100％;对氟康唑敏感率为85.2％;对伊曲康唑敏感率为55.7％;对伏立康唑敏感率为84.3％.结论 上海地区3所医院分离的白念珠菌基因型没有明显区别,同源性分型主要以A型为主.药敏试验显示,该地区白念珠菌对5-氟胞嘧啶、两性霉素B、氟康唑、伏立康唑敏感率较高.
关键词： 白念珠菌 随机扩增多态性DNA 同源性分析 -
山苍子油对白念珠菌全基因组表达谱的影响
目的：应用白念珠菌全基因组表达谱芯片比较山苍子油处理前后白念珠菌基因的差异性表达，分析山苍子油对白念珠菌整个基因表达谱的影响。方法用山苍子油处理白念珠菌 ATCC90028株90 min，将处理后的菌株命名为白念珠菌ATCC90028-L，分别抽提细胞总 RNA，经杂交、洗涤后，通过扫描分析白念珠菌 ATCC90028株和 ATCC90028-L株全基因组表达谱的差异。结果基因芯片共筛选出491个差异表达基因，与白念珠菌 ATCC90028株比较，在 ATCC90028-L株中有216个基因表达上调，有275个基因表达下调，差异表达的基因数量约占总基因数量的11％（491/4634），差异表达基因主要包括白念珠菌麦角固醇生物合成通路中关键靶酶编码基因（ERGs）、应激反应相关基因、DNA复制与损伤修复相关基因、跨膜分子转运相关基因、能量代谢酶类相关基因等。结论山苍子油可使白念珠菌基因组中约11％基因产生差异性表达，影响较为显著，我们推测山苍子油与唑类抗真菌药物的作用机制相似，均通过对白念珠菌麦角固醇生物合成通路中关键靶酶的影响而起作用，基因芯片筛选出的其他差异表达基因也可能与山苍子油的抗真菌作用机制有关，值得进一步研究。
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大肠埃希菌和白念珠菌混合感染小鼠中性粒细胞和巨噬细胞功能的研究
目的:研究大肠埃希菌和白念珠菌混合感染小鼠中性粒细胞和巨噬细胞的功能.方法:建立大肠埃希菌和白念珠菌单独及混合感染小鼠模型,以多粘菌素B拮抗内毒素活性,分离各组小鼠中性粒细胞和巨噬细胞,检测中性粒细胞黏附功能、吞噬功能和巨噬细胞杀菌功能,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子α(TNFα)水平.结果:大肠埃希菌和白念珠菌混合感染组小鼠中性粒细胞黏附率较各自单独感染组明显升高(P＜0.05),而吞噬率较各自单独感染组明显降低(P＜0.05),大肠埃希菌和白念珠菌混合感染组小鼠巨噬细胞杀菌率较各自单独感染组明显降低(P＜0.05),分泌TNFα水平较各自单独感染组明显升高(P＜0.05).结论:大肠埃希菌和白念珠菌混合感染小鼠中性粒细胞和巨噬细胞清除细菌能力低下,巨噬细胞分泌过量TNFα可削弱机体抵抗力.
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治疗策略对念珠菌血症及其他类型侵袭性念珠菌病患者预后的影响:一项对随机研究进行的患者水平的定量分析
近20年的流行病学研究表明,白念珠菌已成为第4位常见的医院血流感染的病原菌.虽然对感染危险因素的认识以及感染的预防已取得长足进展,但念珠菌血症相关住院率和病死率仍呈上升趋势.侵袭性念珠菌病的病死率接近50％.虽然有许多抗真菌药物可供选择,但佳治疗方案仍未达成共识.本文对各项临床研究中患者的个体资料进行分析,探讨不同治疗方案对念珠菌血症患者及其他侵袭性念珠菌病患者预后的影响.
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生物膜中白念珠菌的耐药性研究
白念珠菌（Canida albicans）是人类常见的条件致病真菌，健康者带菌率以口腔高，约80％［1］。当机体免疫力下降或使用免疫抑制剂时，白念珠菌可导致严重的感染性疾病，在美国医院感染中列第4位，其病死率为30％～70％［2-3］。研究发现，在难治性白念珠菌感染的病灶中大多存在生物膜。自然界中99％微生物以生物膜的形式存在，65％人类感染性疾病与生物膜相关［4］。
