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白念珠菌钙调蛋白基因单点突变重组质粒的构建和鉴定
目的:构建白念珠菌钙调蛋白基因(CMD1)单点突变重组质粒,为进一步探讨CMD1突变对真菌生长周期及致病性的影响奠定基础.方法:采用PCR定点突变法,将CMD1 编码 C端3个苯丙氨酸(F89、F92和F141)的碱基分别定点突变成编码丙氨酸的碱基,构建CMD1单点突变重组表达质粒,并进行序列测定.结果:测序结果证实,所构建的3个重组质粒均含有相应的CMD1定点突变后的序列,F89+:TTC→GCT;F92+:TTT→GCC;F141+:TTT→GCC.结论:成功构建了3个CMD1单点突变重组表达质粒,为后续研究奠定了基础.
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白念珠菌钙调蛋白定点突变对重组菌株形态与生长的影响
目的:研究白念珠菌钙调蛋白(Cmd1)定点突变对重组菌株生长状态的影响.方法:以不同的培养温度培养Cmd1定点突变重组菌株,分析其温度敏感性,在光镜下观察Cmd1定点突变后重组菌株形态发生和生长速度的变化.结果:重组菌株B(F92+)和E(F89+F141+)菌株具有温敏性,在适当温度下才能生长,而重组A(F89+)和C(F141+)菌株无温敏性.光镜观察发现对照组、重组菌株A 和C细胞芽体呈圆形或椭圆形,芽颈较短;而B和E菌株可见多数为细长的芽体,但也可见少许为圆形和椭圆形的芽体.B和E菌株培养早期的菌体总数明显少于对照组、A和C菌株的菌体总数(P<0.05).结论:Cmd1 F92+和F89+F141+定点突变导致重组菌株具有温度敏感性,并影响了重组菌株细胞形态的正常发生和生长速度.
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白念珠菌钙调蛋白定点突变重组菌株的构建和鉴定
目的:构建白念珠菌钙调蛋白(Cmd1)定点突变重组菌株,为进一步探讨钙调蛋白基因突变对真菌生长周期及致病性的影响奠定基础.方法:将含白念珠菌钙调蛋白基因(CMD1) 定点突变的重组质粒转染CMD1缺陷HIS3+重组单倍体菌株,用His/Trp省却培养基和His/Trp/Ura省却培养基联合选择培养筛选到Cmd1定点突变酵母菌株.结果:经选择培养筛选得到能在His/Trp省却培养基上生长而不能在His/Trp/Ura省却培养基生长的菌株4株.结论:成功构建了4株Cmd1定点突变重组菌株, 为进一步探讨Cmd1定点突变对白念珠菌生物学特性及致病性的影响奠定基础.
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红外光谱法鉴别白念珠菌耐药菌株的初步研究
分别考察了不同菌种与菌株、耐药型与敏感型菌株的红外光谱的特点,以探索鉴别耐药真菌的新方法.结果表明新型隐球菌与白念珠菌呈现较明显的光谱差异;白念珠菌的耐药型与敏感型菌株之间的光谱差异较小,但仍能用于初步鉴别.提示红外光谱法可以用于不同菌种与菌株、耐药型与敏感型菌株的快速、简便的鉴别.
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白念珠菌总蛋白质组二维电泳条件的建立和优化
目的:建立并优化白念珠菌总蛋白质组分析的二维电泳条件.方法:以白念珠菌国际标准菌株SC5314为材料,制备其总蛋白质组样品.以真菌细胞破碎方法、裂解液成分、上样量、固相pH梯度胶条的选择为侧重点,通过不同条件下电泳图谱的比较建立佳二维电泳技术条件.结果:成功建立白念珠菌总蛋白质制备方法,优化了白念珠菌蛋白质组分析的二维凝胶电泳技术,获得重复性和分辨率都较理想的白念珠菌总蛋白质二维电泳图谱.结论:优化后的二维电泳条件符合白念珠菌的特点,为白念珠菌蛋白质组分析奠定基础.
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白念珠菌基因中断技术研究进展
白念珠菌是能感染人体的重要微生物之一.由于白念珠菌的遗传学操作较困难,因此其基因功能的研究主要依赖于酿酒酵母作为模型或替代性表达宿主.近年来,以白念珠菌自身作为宿主的基因中断技术逐渐成为研究其基因功能的主要手段,本文对这一领域的研究进展作一综述.
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颗粒溶素肽对白念珠菌的毒性作用
目的:研究颗粒溶素肽对白念珠菌的毒性作用.方法:将白念珠菌和不同浓度的颗粒溶素肽混合培养后,计算沙氏琼脂培养基平板上白念珠菌菌落数.采用标准微量稀释法测定颗粒溶素肽以及氟康唑( FCZ)对白念珠菌的低抑菌浓度(MIC).结果:当相应于颗粒溶素第2和第3个螺旋的肽段G2和G3浓度达到20 μg/ml时,对白念珠菌产生较强的细胞毒性,形成的平均菌落数分别从883、937降到203、218,而G1、G4、G5肽段浓度达到40 μg/ml时,也不能明显减少白念珠菌平均菌落数.3株标准白念珠菌株对颗粒溶素肽均较为敏感,MIC 分别为26、22、29 μg/ml,而对FCZ 的MIC分别为4、20、128 μg/ml.结论:颗粒溶素肽对白念珠菌具有细胞毒性,是人体内天然存在的抗真菌感染物质之一,具有潜在的药物开发意义.
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氟康唑与5-氟胞嘧啶体外联合抗白念珠菌临床分离株的研究
目的评价白念珠菌临床分离株对氟康唑和5-氟胞嘧啶联合用药的敏感性及判断两药物之间相互作用的方式.方法采用美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)M27-A推荐的棋盘微量稀释法,检测了30株白念株菌临床分离株对氟康唑、5-氟胞嘧啶及两药联合的体外药物敏感性,同时对两药的作用方式进行判定.结果联合用药时显著减少了每一药物MIC值的几何均数,在40%受试菌表现为协同作用方式,在53.3%的受试菌株表现为相加作用方式,在6.7%受试菌株表现为无关作用方式,未观察到拮抗作用出现.结论氟康唑和5-氟胞嘧啶联合比单一药物体外抗白念珠菌的活性高.
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随机分离致病性白念珠菌17例的基因分型
目的研究白念珠菌不同基因型的同源性,以及在菌株群中分布的特征,为白念珠菌的分子流行病学研究找到一个方法. 方法扩增出白念菌株CDC 3(保守基因)的部分片段并测序,应用Vector-NTI软件包进行比较.结果 17株菌株被分为9个基因型,有8株菌株的基因型高度同源,有9株的基因同源性较高,这9株菌株的基因型在样本分布中占优势;高度同源的8株菌株与其它菌株的主要区别在于,在第195～205位缺少TTTCTTCTT,在第338～345位多了TAAGTAAG.结论菌株3等9个菌株的基因型在样本分布中占优势,可能是进化过程中为适应宿主的结果.
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白念珠菌三重保守基因微卫星快速分型
目的建立高效、快速、简便的白念珠菌三重保守基因微卫星分型技术.方法煮沸法处理71株白念珠菌野生株为模板,三色荧光分别标记保守基因CDC 3、EF 3和HIS 3微卫星序列引物,PCR扩增,产物行聚丙烯酰胺凝胶电泳.Gene Scan软件扫描获取片段精确长度,Genotype软件基因分型.结果71株白念珠菌野生株行CDC 3、EF 3和HIS 3基因分型分别获得5、10、8种等位基因,7、8、9种基因型,三位点联合分析获得14种菌株基因型.结论白念珠菌多重保守基因微卫星分型能够从基因水平快速、精确地鉴定和区分临床分离株,对白念珠菌的流行病学和致病性研究有重要价值.
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裸小鼠、昆明种小鼠感染白念珠菌或新生隐球菌脾脏自然杀伤细胞活性研究
目的 研究裸小鼠、昆明种小鼠在分别感染白念珠菌或新生隐球菌,并给予伊曲康唑和γ-干扰素(IFN-γ)治疗前、后,脾脏自然杀伤(NK)细胞活性变化.方法 首先建立裸小鼠、昆明种小鼠分别感染白念珠菌或新生隐球菌实验动物模型,并给予伊曲康唑、IFN-γ及伊曲康唑和IFN-γ联合治疗,检测小鼠脾脏NK细胞活性的变化.结果 建立裸小鼠、昆明种小鼠分别感染白念珠菌或新生隐球菌实验动物模型后,小鼠脾脏NK细胞活性均明显下降(P值均＜0.01);分别给予伊曲康唑、IFN-γ、伊曲康唑和IFN-γ联合治疗后,NK细胞活性均有不同程度的恢复(P值均＜0.01).结论 伊曲康唑及IFN-γ治疗具有促进感染白念珠菌、新生隐球菌的裸小鼠、昆明种小鼠免疫功能的作用.
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白念珠菌和新生隐球菌系统感染裸小鼠模型的建立
目的建立白念珠菌和新生隐球菌系统感染裸小鼠模型.方法采用对裸小鼠腹部注射白念珠菌及隐球菌菌悬液的方法,观察记录1～2 d内裸小鼠的毒性反应情况和死亡分布,并进行病理检查.根据寇氏法设计测定半数致死量(LD50),并检测感染前后脾脏自然杀伤(NK)细胞活性的变化.结果分别观察白念珠菌和新生隐球菌菌悬液对裸小鼠的急性毒性;检测到裸小鼠腹腔注射白念珠菌菌悬液的LD50为1.6×107cfu/ml,注射新生隐球菌菌悬液的LD50为2.0×107cfu/ml.白念珠菌、新生隐球菌感染裸小鼠时,脾脏组织NK细胞的活性下降.结论建立了白念珠菌和新生隐球菌系统感染裸小鼠模型,为讨论在T细胞为主的细胞免疫缺失的情况下,以B细胞NK细胞为主的体液免疫系统如何应对白念珠菌和新生隐球菌感染提供了一个极好的实验动物模型.
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白念珠菌CDR1基因上游调控序列与氟康唑耐药的关系初探
目的探讨白念珠菌耐药基因CDR1基因上游调控序列对氟康唑耐药的影响.方法分别抽提氟康唑耐药/敏感配对菌株DNA,通过特异性合成CDR1基因上游调控序列引物,分析该序列在氟康唑耐药/敏感配对菌株中是否存在基因突变.结果白念珠菌氟康唑耐药/敏感配对菌株中的CDR1基因上游调控序列未出现任何碱基突变和缺失.结论白念珠菌氟康唑耐药与CDR1基因上游调控序列是否突变无关.
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白念珠菌CDR1基因表达与氟康唑耐药的关系
目的了解在白念珠菌氟康唑耐药或敏感菌株中CDR1基因的表达情况.方法抽提氟康唑耐药/敏感菌株的RNA,采用Northern blot技术观察CDR1基因的表达.结果白念珠菌耐药菌株CDR1基因的表达量明显高于对应的敏感菌株.结论白念珠菌CDR1基因的高表达与氟康唑耐药有关.
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肾移植术后患者白念珠菌分离株的唑类药物敏感性观测
目的了解肾移植术后患者分离的白念珠菌对唑类药物的敏感性.方法参照美国国家临床实验标准委员会(NCCLS)公布的M27-A方案微量稀释法,对我院近年的19株肾移植术后患者的白念珠菌临床分离株进行氟康唑和伊曲康唑药物的敏感性观测.结果19株临床分离株中,发现氟康唑耐药株7株,敏感株8株,剂量依赖的敏感菌株4株;伊曲康唑耐药株9株,敏感株8株,余2株为剂量依赖的敏感菌株.结论目前肾移植患者人群白念珠菌分离株存在严重的唑类药物耐药,而且氟康唑和伊曲康唑之间也存在交叉耐药.
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以真菌性食管炎为首发症状的艾滋病一例
1 临床资料 患者男,58岁,已婚.因"消瘦伴胸骨后疼痛1个月余"入院.1个月前患者无明显诱因下出现胸骨后灼热疼痛,伴吞咽不适,食欲不振,体重减轻＞5 kg,无恶心呕吐,无腹痛、腹泻等.当地医院胃镜检查为真菌性食管炎可疑;咽拭培养为白念珠菌.自服土药调理后病情无好转,门诊以"真菌性食管炎"收入院.
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六神栓对小鼠白念珠菌阴道炎治疗作用的实验研究
目的 观察自制六神栓对小鼠白念珠菌阴道炎的治疗作用.方法 采用ICR雌性小鼠构建白念珠菌阴道炎模型,随机分为六种栓3个剂量组及生理盐水组和保妇康栓组,每组9只小鼠,采用阴道给药,1次/d,连续7d,以阴道灌洗载菌量为观察指标.结果 各个剂量的六神栓均能降低阴道灌洗液菌落计数,与生理盐水组比较有显著性差异(P＜0.05).随着六神栓治疗剂量的增高,菌落计数逐渐下降,且差异有显著性(P＜0.05).结论 六神栓对小鼠白念珠菌阴道炎有治疗作用.
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白念珠菌H3K4甲基转移酶N末端肽段Set1-208p的原核细胞表达及鉴定
目的 原核细胞表达白念珠菌H3K4甲基转移酶N末端肽段Set1-208p,鉴定重组蛋白质的抗原性.方法 用比对软件对白念珠菌H3K4甲基转移酶与其他物种甲基转移酶进行比对.选择与人类无同源性的抗原特异性片段,以白念珠菌C1标准株基因组DNA为模板,PCR扩增Set1-208p的编码基因,以pET28a(+)为载体,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白质表达.用抗His标签的单克隆抗体鉴定融合蛋白,并用确诊侵袭性白念珠菌感染(IC)患者血清进行抗原性鉴定.结果 成功克隆了白念珠菌抗原特异性H3K4甲基转移酶片段Set1-208p基因并诱导表达,获得了纯化的重组肽段,所得蛋白质分子量(Mr)约为29000,带有His标签,经western blot鉴定,诱导的重组蛋白可与IC患者血清特异性反应.结论 成功诱导表达了具有良好抗原反应性的Set1-208p重组蛋白质,为建立相应的抗原、抗体ELISA检测方法提供基础.
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白念珠菌果糖二磷酸醛缩酶重组蛋白的制备及鉴定
目的 制备有免疫原性的白念珠菌果糖二磷酸醛缩酶(fructose-bisphosphate aldolase,Fba1)重组蛋白.方法 以白念珠菌C1标准株基因组DNA为模板,用PCR法扩增Fba1 DNA序列,与克隆载体pMD18-T连接、测序,再与原核表达载体pET28a(+)连接,构建成重组表达质粒pET28a(+)/Fba1,转化大肠埃希菌BL21( DE3),IPTG诱导重组融合蛋白表达,亲和层析柱纯化重组蛋白.用抗His标签的单克隆抗体鉴定融合蛋白,并用确诊为侵袭性白念珠菌病(ICAI)、且抗白念珠菌烯醇化酶抗体阳性的患者血清进行抗原性鉴定.结果 Fba1 DNA序列与GenBank中的序列一致.在大肠埃希菌中获得白念珠菌Fab1重组蛋白的高效表达,表达产物以可溶性蛋白为主,终蛋白质得率为7.6 mg/g湿菌.经免疫印迹鉴定,重组蛋白与抗His标签的单克隆抗体和确诊ICAI患者血清呈特异性反应,显示出良好的抗原反应性.结论 成功制备了具有良好抗原反应性的重组蛋白,为建立特异性诊断ICAI的新方法打下基础.
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用系统性念珠菌感染小鼠模型评价白念珠菌蛋白Eno1、Bgl2、Pgk1的免疫反应性
目的 用系统性念珠菌感染小鼠模型评价白念珠菌蛋白烯醇化酶1(Eno1)、β-葡萄糖苷酶2(Bgl2)、磷酸甘油激酶1(Pgk1)的免疫反应性.方法 腹腔注射环磷酰胺致小鼠免疫力低下后,再腹腔注射白念珠菌SC5314以制备系统性念珠菌感染小鼠模型;用ELISA法和western blot法分析重组Eno1、Bgl2和Pgk1蛋白与模型小鼠血清抗体的免疫反应性.结果 建模小鼠肠系膜边缘有米黄色细小颗粒,腹腔中有菌丝样生长的念珠菌,肾脏中可检测到念珠菌生长.小鼠感染白念珠菌6～8d后出现抗Eno1、抗Bgl2和抗Pgk1的IgG类抗体,效价峰值出现在感染后第20 ～ 24天.抗Eno1抗体效价高,其次为抗Pgk1,抗Bgl2低.Eno1与小鼠血清免疫反应性强,Bgl2免疫反应性较弱.结论 念珠菌可有效刺激小鼠产生抗Eno1、抗Bgl2和抗Pgk1的IgG类抗体.重组Eno1蛋白免疫反应性强,可用于后续研究.
