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hBMP-2基因转染兔骨髓间充质干细胞体内移植后hBMP-2的活性检测
目的 探究人骨形态发生蛋白-2(human bone morphogenetic protein-2,hBMP-2)基因植入兔股骨头坏死模型体内后的活性,为后续实验奠定理论基础.方法 1.采用髓芯减压联合液氮冰冻法制备兔股骨头坏死模型;2.将造模成功的兔子随机分为A、B、C3组(n=12),A组不植入材料,为对照组,B、C组分别植入DBM/BMSCs、hBMP-2/BMSCs/DBM;3.术后第1、第2、第3周各组分别处死4只兔子,分别运用PCR、RTFQ-PCR、Western Blot检测股骨头内hBMP-2基因和蛋白的表达量,评估hBMP-2基因在兔体内的活性.结果 植入后,在第1、第2、第3周,PCR结果示:A、B两组hBMP-2基因呈阴性表达,C组hBMP-2基因呈阳性表达;RTFQ-PCR示:C组相对表达量分别为1,0.947±0.025,0.895±0.059,P=0.081;Western blot示:A、B两组hBMP-2蛋白在兔体内呈阴性表达,C组hBMP-2蛋白呈阳性表达;凝胶成像系统分析显示:C组hBMP-2蛋白表达灰度值(目的/内参)分别为:0.530±0.056、0.507±0.066、0.475±0.086,且两两之间比较P＞0.05.结论 hBMP-2基因转染BMSCs植入兔股骨头坏死模型体内后能够稳定表达,进而能够持续诱导BMSCs向骨细胞分化,达到修复股骨头坏死的目的.
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羟基磷灰石/聚乳酸-聚羟乙酸/骨形态发生蛋白复合生物材料在兔体内生物组织相容性的研究
目的 评价快速成型工艺制作的羟基磷灰石/聚乳酸-聚羟乙酸/骨形态发生蛋白(HA/PLGA/BMP-2)生物材料在新西兰兔体内的生物组织相容性.方法 健康新西兰大白兔20只,随机抽取10只为实验组,10只为对照组.实验组于兔颅顶部植入HA/PLGA/BMP-2生物材料,对照组植入金属钛网.分别于4周、8周、12周通过HE染色、血常规、血生化等评价方法,评价HA/PLGA/BMP-2生物材料在兔体内的组织相容性.结果 实验组植入物周围组织(约1 cm)HE染色结果显示:4周见部分中性粒细胞,少量炎性细胞浸润;8周未见中性粒细胞,无炎性细胞浸润;12周未见炎性细胞,周围可见成纤维细胞增生.对照组植入物周围组织(约1 cm)HE染色结果显示4周、8周、12周均未见有炎性细胞生成.实验组、对照组肝、肾组织HE染色结果显示均未见有炎性细胞,无新生组织形成.实验组与对照组12周血液学结果比较,差异无显著性意义.结论 HA/PLGA/BMP-2生物材料具有良好的生物相容性,是一种安全、无肝肾毒性的生物材料,在新型骨组织工程材料上有一定的研发潜力.
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人脱细胞骨复合骨髓基质细胞成骨活性的实验研究
目的研究人脱细胞骨(HAB)复合经诱导的骨髓基质细胞的实验效果,观察细胞的黏附和生长情况,并对其成骨活性进行检测.方法用15%的过氧化氢和乙醚去除人髂骨块内的结缔组织和细胞成分,消毒后制备人脱细胞骨.取材活体或新鲜尸体的骨髓行骨髓基质细胞培养,细胞纯化后加入β-甘油酸钠,地塞米松和抗坏血酸等向成骨方向诱导,并进行对照培养.通过碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(OCN)检测来确定骨髓基质细胞的增殖和分化情况,将诱导的骨髓基质细胞浓缩后复合到制备好的脱细胞骨块内进行复合培养.8 d后通过光镜和电镜等形态学观察以及生化指标检测来确定细胞的成骨活性.结果人髂骨块内细胞清除干净,骨基质保存良好;诱导后的骨髓基质细胞ALP和OCN水平明显高于对照组(P＜0.05);复合后的人脱细胞骨培养液中ALP和OCN检测呈阳性;骨髓基质细胞在HAB支架内附着紧密,生长良好.结论人脱细胞骨复合经诱导的骨髓基质细胞在体外具有有效的成骨功能,是一种较为理想的骨组织工程材料.
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骨髓基质细胞向成骨细胞诱导分化的研究进展
骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSC)是位于骨髓中的一种干细胞,因在体外经适当的培养条件可以向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞等多种间充质来源的组织细胞分化,又被称为间充质干细胞(mesenchymal stem cell).骨髓基质细胞位于骨髓,具有取材方便,易于体外扩增,自体移植无免疫排斥性等优点,是骨组织工程中种子细胞的理想来源.骨髓基质细胞,其向成骨细胞的定向诱导分化将是关键的一步.笔者就骨髓基质细胞向成骨细胞诱导分化有关影响因素的研究进展作一综述.
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脊柱融合动物模型的研究进展
随着对脊柱融合机理及其并发症的进一步认识以及研究逐渐深入,动物模型在脊柱外科领域的应用越来越广泛.尤其是近年,骨组织工程和基因治疗受到了极大的关注,脊柱融合实验动物模型在评价这些新兴技术方面的作用日益显著,为相关的基础与临床前期研究做出了巨大贡献.现就有关内容做一综述.
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生物材料与支架在骨组织工程领域的研究进展
因严重创伤、肿瘤、畸形等导致的骨缺损一直是临床骨科治疗的重点及难点.近几年来,组织工程学的飞速发展,导致了形形色色的人工骨的出现.新型的人工骨材料更加关注于如何实现快速骨整合与生理性骨重建.本文从人工骨支架应用的要求、构建材料的种类以及未来的挑战与机遇等几个方面对骨组织工程学支架的研究及发展情况作了系统的综述.
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人尿源干细胞及其在骨组织工程中应用的研究进展
骨组织工程领域已围绕种子细胞、支架材料、生长信息三个基础方向开展研究.干细胞是当前被广泛研究的种子细胞,从尿中分离得到的人尿源干细胞(hUSC)可贴壁生长,具有克隆性,可表达多数间充质干细胞标志物、外周细胞标志物,具备多分化潜能,经数代培养仍保持核型稳定,无成瘤性.hUSC获取途径无创且简便、培养体系稳定、具备多向分化潜能,有成为组织工程种子细胞新来源的潜力.
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骨组织工程中细胞外基质材料的选择
成骨细胞种植的细胞外基质材料的选择是骨组织工程研究中的关键环节，也是限制骨组织工程研究进一步发展的主要因素之一。理想的骨组织工程细胞外基质材料的要求有[1，2]：(1)良好的生物相容性：除满足生物医用材料的一般要求，如无毒、不致畸等之外，还要利于种子细胞粘附、增殖，降解产物对细胞无毒害作用，不引起炎症反应，甚至利于细胞生长和分化。(2)良好的生物降解性：基质材料在完成支架作用后应能降解，降解率应与组织细胞生长率相适应，降解时间应能根据组织生长特性作人为调控。(3)具有三维立体多孔结构：基质材料可加工成三维立体结构，孔隙率好达90％以上，具有高的面积体积比。这种结构可提供宽大的表面积和空间，利于细胞粘附生长，细胞外基质沉积，营养和氧气进入，代谢产物排出，也有利于血管和神经长入。(4)可塑性和一定的机械强度：基质材料具有良好的可塑性，可预先制作成一定形状。并具有一定的机械强度，为新生组织提供支撑，并保持一定时间直至新生组织具有自身生物力学特性。(5)良好的材料-细胞界面：材料应能提供良好的细胞界面，利于细胞粘附、增殖，更重要的是能激活细胞特异基因表达，维持细胞正常表型表达。目前，在骨组织工程研究中应用的细胞外基质材料主要有生物类材料、生物陶瓷类材料、聚合物类材料以及复合类材料。以上述要求衡量，这些材料各具优势和不足，现综述如下。
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骨髓基质细胞体内成骨研究进展
骨髓分为造血和基质两大系统,其成骨能力主要来源于骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells, BMSC).BMSC所含的少量多能基质干细胞,是多种细胞的前体细胞,具有多向分化潜能,能够向成骨系细胞、成纤维系细胞、网状细胞、脂肪细胞和内皮细胞等分化[1].BMSC在适宜的培养条件下增殖分化为成骨细胞具有较高的碱性磷酸酶活性,可分泌骨钙素,合成并分泌Ⅰ型胶原等[2].由于BMSC来源充足、取材方便、使用安全、成骨能力确切、便于临床应用,将其作为骨组织工程的种子细胞来源,研究其体内成骨作用,受到了广泛的关注.
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绿色荧光蛋白体外转染与体内示踪成骨细胞的研究
目的观察经腺病毒介导的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)转染的成骨细胞的体外表达及体内示踪情况,探讨GFP作为组织工程种子细胞示踪剂的可行性.方法以腺病毒为载体,293A细胞为包装细胞,介导GFP转染成人骨髓源成骨细胞,与未转染的同期细胞作对照,在相差显微镜和荧光显微镜下观察,流式细胞术检测GFP表达效率;分别检测转染后两组细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性与骨钙素(OCN)的含量;并将GFP转染8 d后的成骨细胞植入裸鼠股部肌袋内,术后4、8周取材进行荧光显微镜、HE染色组织学和免疫组织化学染色观察.结果GFP转染的骨髓源成骨细胞表达绿色荧光的阳性率达75%以上,转染8 d后的成骨细胞表面抗原标志CD29、CD44高效表达,而CD34不表达;转染后4、8 d细胞内ALP活性与OCN含量与未转染组比较差异无显著性意义(P＞0.05).GFP转染8 d后的成骨细胞植入裸鼠体内4、8周均可表达明显的绿色荧光,并具有成骨细胞的形态特征,ALP免疫组化染色呈黄褐色.结论GFP能在体外转染、裸鼠体内示踪成骨细胞,是一种可用于组织工程研究的理想的活细胞示踪剂.
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纳米羟基磷灰石/胶原/聚乳酸材料复合自体骨髓基质细胞修复犬下颌骨节段性缺损的实验研究
子细胞的归宿.同时设自体髂骨移植组及单纯材料植入组作为对照.结果 术后6个月,下颌骨缺损区被nHAC/PLA+BMSCs复合形成的组织工程骨完全修复,形态恢复良好,大量成熟的骨组织充满缺损区的全层,材料大部分被吸收.从免疫组织化学染色结果看,组织工程骨细胞来源于种子细胞BMSCs.用钛重建板和微型钛板联合固定或单纯用钛重建板固定都可行.结论 nHAC/PLA作为支架材料与自体BMSCs复合形成的组织工程骨可以修复大动物承力骨较大的节段性缺损,并可直接用钛重建板对其进行固定.
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应用人恒牙牙髓干细胞与明胶支架构建组织工程骨的研究
目的 构建由人恒牙牙髓干细胞和三维明胶支架组成的组织工程骨,并验证其成骨效果.方法从正畸治疗减数拔除的恒前磨牙牙髓组织中应用酶消化法获得牙髓细胞,单抗Stro-1标记、免疫磁珠阳性分选系统分选获得牙髓干细胞.第3代细胞被分别接种到6孔板或三维明胶支架上进行成骨向诱导培养,诱导14天后支架组移植入裸鼠背部皮下.应用ALP染色、Von Kossa染色验证牙髓干细胞的体外成骨能力;应用X线、HE染色和免疫组化验证组织工程骨的体内成骨效果.结果 牙髓干细胞体外成骨向诱导后7、14天ALP染色呈阳性;14、21天Von Kossa染色形成矿化结节.在体内组织工程骨成骨明显,X线显示实验侧支架内有团块状高密度阻射影;HE染色显示大量的骨组织形成;免疫组化显示骨结构区域骨桥蛋白、骨涎蛋白和骨钙素阳性表达.结论 人恒牙牙髓干细胞和明胶支架构建形成了组织工程骨.
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可注射镁合金/硫酸钙成骨复合材料的制备及性能研究
目的:本研究采用半水硫酸钙晶体(Calcium sulphate hemihydrate,CSH)与可吸收镁合金(Magnesium alloys,Mgalloys)制备出一种可注射的新型复合人工骨材料,并研究其可注射性,机械性能,生物相容性、生物降解等各方面的性能.方法:对比不同比例Mg/CSH复合材料的初、终凝时间、压缩强度、注射特性;采用X线衍射分析(X-ray diffraction analysis,XRD)和能量弥散X射线探测器(Energy Dispersive X-ray Detector,EDX)对材料成分进行分析;模拟体内液态环境,测试材料在37℃浸泡环境下的生物活性及在磷酸缓冲盐浸泡下的重量变化以及pH变化;材料表面形态采用扫描电镜(Scaning electron microscopy,SEM)观察;用大肠杆菌抑菌性实验对材料的抗菌性进行检测.结果:与纯CSH组相比,添加Mg的复合材料凝固时间延长,复合材料的可注射性显著提高(纯CSH的可注射比例为43％,20％ Mg/CSH为69％).随着Mg含量的提高,抗压强度方面也有所提高(K0.05).XRD及EDX检测结果均证明材料中含有CSH以及Mg晶体.不同复合材料在浸泡环境下的结果表明,Mg的添加对复合材料的pH无影响;降解率方面,在浸泡时间小于21d时,纯CSH与Mg/CSH复合材料的降解速度差异无统计学意义;在浸泡21d后,复合材料的降解性明显优于纯CSH (P＜ 0.05).SEM检测浸泡前后材料表面,结果表明浸泡对材料差异无统计学意义;20％ Mg/CSH及10％ Mg/ CSH与纯CSH 24h后抑菌性能的差异有统计学意义.结论:添加镁合金的可注射硫酸钙复合材料展示出良好的机械性能,在可注射能力、抗菌性,体内生物相容性方面也表现良好.该材料具有潜在的临床应用价值.
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外周血作为骨组织工程种子细胞来源的初步研究
目的:研究外周血作为骨组织工程种子细胞来源的可能性.方法:密度离心法分离兔外周血单个核细胞,冲洗收集长骨内骨髓,将两者在体外进行培养.检测两种来源细胞的表面分子标志物及成脂、成骨能力差异.结果:骨髓原代培养细胞集落形成早,细胞形态均一.传代后CD29阳性,CD34阴性,成脂诱导时脂滴出现早且多;成骨诱导时碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原表达早,矿化结节数量多且体积大.外周血原代培养细胞集落形成晚,形态不一,种类多.传代后CD29阳性,CD34弱阳性;成脂诱导时脂滴出现晚且少;成骨诱导时碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原表达较晚,有散在的矿化结节和管样结构形成.结论:外周血内含有间充质干细胞、内皮祖细胞等多种干细胞,可以作为血管化组织工程骨的种子细胞来源,但需要进一步优化培养方法.
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自体骨移植修复种植位点骨缺损的研究进展
针对患者的牙列缺损或牙列缺失,种植牙是一种有效的修复技术,但患者由于长期缺牙或因炎症、外伤、肿瘤导致的牙槽骨严重缺损,影响了牙槽骨对种植体的支持,常导致种植牙的失败.针对种植位点骨量的严重缺损,需在种植之前或种植同期进行骨移植手术.近年来,不同形式的自体骨、异种骨和人工骨移植技术在口腔种植手术中被广泛使用,一定程度上扩大了种植手术的适应征,提高了骨量不足条件下种植的成功率.针对不同的缺损情况,选择适合的骨移植技术成为目前研究的热点.同时,用于修复种植位点骨缺损的骨组织工程研究也取得了一定的进展,目前正进行临床前研究.本文回顾了近年来骨移植技术的相关研究,重点综述了自体骨全身取材位点和口内取材位点的选择、自体骨块的取材形式和新技术的运用,展望了自体颌骨骨髓间充质干细胞在骨组织工程领域的应用前景.
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骨组织工程血管化的研究进展
骨组织工程在组织工程学中研究较多、发展较快,但随着骨组织工程由基础研究向临床过渡,其面临着血管化的问题.目前有关组织工程化骨组织中血液供应的重建研究主要集中在以下方面:①利用生长因子促进血管的生成;②血管内皮细胞与成骨细胞联合培养支架后植入体内;③显微外科技术与骨组织工程联合应用促进血管形成.
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骨组织工程的研究
“组织工程学”这个名称是1987年被正式提出的，早的定义是：“应用工程学和生命科学的原理和方法，认识哺乳动物正常和病理组织中结构-功能关系，并开发生物代用品，以恢复、维持或改善组织的形态和功能”。随着组织工程学研究的深入和发展，其内涵不断扩大。近年来，有人将生物材料诱导细胞分化、组织再生亦归于组织工程学范围，其定义也将会有所更改。组织工程的基本做法是，取少量自体组织，在体外分离、培养细胞，将一定量的培养细胞接种到具有一定空间结构的三维支架材料上，再将此细胞-支架复合物在体外继续培养，并植入体内培养，通过细胞生长繁殖、相互贴附、分泌细胞外基质，形成具有一定结构和功能的组织或器官。 1.骨的组织工程：骨组织工程是继软骨组织之后研究得较早、较多的对象。Vacanti(1993年)等将小牛骨膜细胞种植于多层编织的聚羟基乙酸(polyglycolic acid, PGA)支架中，然后移植于裸鼠体内，结果证实骨细胞可以增殖成为骨骼；Crane等［1］全面提出了骨组织工程研究的概念、方法、现状和前景，引起了广大学者的关注。近年来骨组织工程研究进展主要有两个方面：一是骨组织诱导；二是细胞传输［2］。和其他组织的组织工程研究原理和方法一样，组织工程骨的研究主要也是集中在种子细胞、支架材料和骨的构建3个方面。
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骨缺损修复生物材料与骨再生
大范围颌骨缺损是临床上亟待解决的难题,随着生物材料、干细胞及骨组织工程技术的发展,为颌骨再生提供了新的思路和希望.用于大块颌骨再生的支架除需满足骨修复材料的基本要求外,还需要具有调控干细胞参与骨再生的能力.支架材料的成分优化、孔隙结构设计、结合凝胶及微球体使用等方法能增加干细胞的体内投递量;通过药物缓控释、微纳米结构和离子成分改性,可以促进干细胞的成骨分化;三维打印技术和管道设计等方法在大支架制备中的应用有助于解决个性化精确修复及血管化的问题.只有通过各方面的协同优化,才有望获得适用大块颌骨再生的生物支架材料.本文重点从生物材料调控干细胞的投递、存活和分化及其在骨再生中的作用等角度进行阐述.
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骨髓基质细胞修复骨缺损的实验研究
目的 探讨骨髓基质细胞(BMSC)对骨缺损的修复作用.方法 实验动物为新西兰大白兔,抽取2 ml骨髓制成细胞悬液,体外培养2周.采用外科手术的方法在兔双侧桡骨处形成1.5 cm的骨膜-骨缺损,将培养2周的骨髓基质细胞注射到桡骨缺损处,于移植后第1、2、3、4 周末,用钼靶X线分别检查双侧桡骨缺损处的骨形成情况,并取第4周末的骨痂进行组织学检查.结果 移植后实验侧骨痂形成快于对照侧;第4周末,实验侧缺损处全部为骨性骨痂连接,对照侧缺损处仍未形成骨痂连接.结论 BMSC可以促进骨缺损的修复.
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犬骨髓基质细胞复合nHAC/CSH裸鼠皮下成骨的实验研究
目的：评价纳米晶羟基磷灰石/胶原/硫酸钙(nHAC/CSH)—犬骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)复合物体内异位成骨能力。方法：犬骨髓基质细胞(dBMSCs)通过密度梯度离心法分离得到，与nHAC/CSH复合，构建可注射骨，扫描电镜观察细胞生长情况，并将构建的可注射组织工程骨植入裸鼠体内，4周后行HE染色观察异位骨形成情况。结果：扫描电镜观察细胞生长良好，体内研究表明，可注射组织工程骨植入裸鼠皮下4周后有类骨样结构形成。结论：nHAC/CSH复合BMSCs具有良好的成骨活性。
关键词： 骨组织工程 可注射 骨髓基质细胞 纳米晶羟基磷灰石/胶原/硫酸钙 裸鼠
