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应用人恒牙牙髓干细胞与明胶支架构建组织工程骨的研究
目的 构建由人恒牙牙髓干细胞和三维明胶支架组成的组织工程骨,并验证其成骨效果.方法从正畸治疗减数拔除的恒前磨牙牙髓组织中应用酶消化法获得牙髓细胞,单抗Stro-1标记、免疫磁珠阳性分选系统分选获得牙髓干细胞.第3代细胞被分别接种到6孔板或三维明胶支架上进行成骨向诱导培养,诱导14天后支架组移植入裸鼠背部皮下.应用ALP染色、Von Kossa染色验证牙髓干细胞的体外成骨能力;应用X线、HE染色和免疫组化验证组织工程骨的体内成骨效果.结果 牙髓干细胞体外成骨向诱导后7、14天ALP染色呈阳性;14、21天Von Kossa染色形成矿化结节.在体内组织工程骨成骨明显,X线显示实验侧支架内有团块状高密度阻射影;HE染色显示大量的骨组织形成;免疫组化显示骨结构区域骨桥蛋白、骨涎蛋白和骨钙素阳性表达.结论 人恒牙牙髓干细胞和明胶支架构建形成了组织工程骨.
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果蝇裸露角蛋白2对大鼠牙囊细胞成骨向分化的调控机制研究
目的:研究体外果蝇裸露角蛋白2(naked cuticle homolog 2,Nkd2)对大鼠牙囊细胞(rat dental follicle cells,rDFCs)成骨向分化的调控机制.方法:体外培养rDFCs,鉴定其组织来源并进行成骨向分化诱导,茜素红染色验证其成骨向分化能力,激光共聚焦检测检测Nkd2在中rDFCs的表达;采用小RNA干扰技术,干扰rDFCs中的Nkd2表达后进行成骨向分化诱导,western blot检测小RNA干扰对rDFCs表达成骨向分化因子Runx2、Col-1和OCN的影响;免疫荧光染色检测3-catenin在rDFCs中的分布变化,western blot检测小RNA干扰对rDFCs表达蓬乱蛋白1(Dishevelled-1,Dvl-1)的表达变化和Wnt/β-catenin信号通路激活剂Wnt3a与阻断剂FH535处理rDFCs后Nkd2的表达改变.结果:获得体外培养的rDFCs,并成功诱导其成骨向分化,茜素红染色显示矿化结节形成.Nkd2在rDFCs中的表达主要分布于胞浆和胞核周围.Nkd2小RNA干扰后的rDFCs中Runx2、Col-1蛋白表达明显下调,Dvl-1的表达下调.同时,Wnt3a处理组rDFCs中Nkd2蛋白表达量升高,而FH535处理组的表达量下降.结论:Nkd2通过Dvl-1调控Wnt/β-catenin信号通路促进rDFCs的成骨向分化;Nkd2是Wnt/β-catenin信号通路的靶基因,对Wnt/β-catenin信号通路起正反馈调节作用.
关键词： Nkd2 牙囊细胞 成骨向分化 Wnt/β-catenin信号通路 -
Wnt3a蛋白对牙髓干细胞成骨向分化的影响
目的 探讨Wnt3a蛋白对牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSC)成骨向分化的影响,进一步说明Wnt信号通路在DPSC分化中的作用.方法 将不同质量浓度[0(培养液组)、5、20、50及100 μg/L]的Wnt3a蛋白作用于DPSC,于诱导培养的第7天检测其碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,对检测结果进行单因素方差分析;茜素红染色检测矿化结节形成情况;通过实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR,qPCR)检测骨涎蛋白、Ⅰ型胶原、Runt相关转录因子2(Runt-relatedtranscription factor-2,RUNX2)及骨钙蛋白4种骨源性基因的表达,对结果数据采用独立样本t检验进行统计学分析.结果 DPSC诱导7d后检测结果显示,Wnt3a蛋白可抑制ALP的活性,0、5、20、50及100 μg/L组ALP的活性分别为1.076±0.203、0.828±0.118、0.505±0.044、0.499±0.038及0.483±0.060,Wnt3a蛋白质量浓度越高对ALP活性的抑制作用越强;qPCR检测显示,5μg/L Wnt3a蛋白组骨钙蛋白基因阳性表达水平(0.092±0.005)显著低于培养液组(0.858±0.190)(P＜0.05);28 d后茜素红染色结果显示,5 μg/L Wnt3a蛋白对DPSC无明显的诱导矿化现象.结论 Wnt3a蛋白可抑制DPSC成骨向分化.
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AG490对成骨细胞和破骨细胞之间相互作用的影响
目的 体外建立MC3T3-E1细胞与RAW 264.7细胞间接共培养体系,观察AG490对共培养体系中破骨细胞形成的影响.方法 MC3T3-E1细胞经矿化诱导培养后,与RAW 264.7细胞进行间接共培养,经一定浓度AG490(1、5、10μmol/L)分别处理后,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖,氮偶联法检测成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测成骨细胞相关基因骨保护素(OPG)、Ⅰ型胶原(COL1)、ALP、骨钙素(OCN)的表达,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和苏木素染色检测破骨细胞的形成,蛋白印迹法(Western blot)检测破骨细胞中RANK的表达.采用单因素方差分析和双因素方差分析对数据进行统计分析.结果 AG490下调MC3T3-E1细胞矿化过程中OPG、COL1、ALP、OCN mRNA的表达(FOPG=30.120,POPG,AG4901μmol/L=0.021、POPG,AG4905μmol/L=0.221、POPG,AG49010μmol/L=0.003;FALP=67.352,PALP,AG4901μmol/L=0.034、PALP,AG4905μmol/L=0.001、PALP,AG49010μmol/L=0.156;FCOL1=28.158,PCOL1,AG4901μmol/L=0.054、PCOL1,AG4905μmol/L=0.002、PCOL1,AG49010μmol/L=0.4;FOCN=125.375,POCN,AG4901μmol/L<0.001、POCN,AG4905μmol/L<0.001、POCN,AG49010μmol/L<0.001).与RAW264.7细胞单独培养作为对照组相比,MC3T3-E1细胞与RAW 264.7细胞间接共培养明显促进成熟破骨细胞的形成,AG490在这个过程中对破骨细胞的形成起到抑制作用(F=85.391,P共培养组-对照组<0.001,P共培养+AG490组-共培养组=0.035),同时与对照组相比,明显抑制破骨细胞中RANK蛋白的表达(FRANK=376.25,PRANK,AG4901μmol/L=0.468、PRANK,AG4905μmol/L=0.003、PRANK,AG49010μmol/L<0.001).结论 AG490抑制MC3T3-E1细胞成骨向分化,并通过影响OPG/RANKL/RANK信号轴的传递抑制成骨细胞与破骨前体细胞间接共培养过程中破骨细胞的形成.
关键词： 共同培养技术 核因子κB受体活化因子 AG490 成骨向分化 破骨向分化 -
脂质体介导NELL1基因对脂肪干细胞影响的体外研究
目的 研究Nel样分子1型(nel-like type 1 molecular,NELL1)对大鼠脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)增殖和分化的影响.方法 分离培养大鼠ADSCs并进行传代;在成骨诱导条件下,以脂质体为载体,分别搭载NELL1质粒和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)质粒作为实验组和对照组,转染第三代ADSCs;通过MTT、RT-qPCR、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性以及茜素红染色方法检测细胞增殖和分化能力;采用单因素方差分析进行统计学运算.结果 实验组与对照组对比,细胞数量差异无统计学意义(P＞0.05),ALP活性及钙结节形成量实验组明显高于对照组.第3d和第7d时,实验组成骨相关基因Runx2、Col Ⅰ、ALP表达增加(P＜0.01),14d时Col Ⅰ mRNA表达增加(P＜0.05).结论 NELL1对ADSCs增殖无明显影响,促进其向成骨细胞分化.
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生长因子诱导牙髓干细胞成骨向分化研究进展
牙髓干细胞是外胚间充质来源的具有多向分化潜能的成体干细胞,随着组织工程技术的日益发展,其在各类生长因子诱导下成骨向分化体内外形成骨组织相关的研究愈来愈深入.本文就牙髓干细胞的成骨分化特性,能够诱导其成骨分化的生长因子的研究进展作一综述.
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骨形成蛋白-2与转化生长因子-β3对牙髓干细胞成骨向分化的对比研究
目的 探讨转化生长因子-β3(transforming growth factor-β3,TGF-β3)、骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)对牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)成骨向分化的影响.方法 健康新西兰幼兔4只,取牙髓组织采用酶解组织块法分离培养获得DPSCs,镜下观察细胞形态及生长状况.将培养的第3代DPSCs分为BMP-2组和TGF-β3组,分别加入浓度为80 μg/L的BMP-2、TGF-β3的完全培养液,采用免疫组织化学法于诱导第3、7天检测Ⅰ型胶原蛋白(collagen-Ⅰ,COL-Ⅰ)表达,于第7、14天检测骨钙素(osteocalcin,OC)表达;诱导第7、14天,对BMP-2组、TGF-β3组行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色后,倒置显微镜下观察ALP活性染色结果.结果 兔DPSCs分离、培养48 h,组织块周围有细胞游出、贴壁生长,培养的第3代兔DPSCs大多为长梭形,也可为多角形,呈巢式或集落生长;TGF-β3组诱导第3天COL-1表达的累计吸光度(integrated optiacal density,IOD)值(159 676.79±63 959.56)高于BMP-2组(44 047.33±15 853.65) (P＜0.05),诱导第7天COL-1表达的IOD值(245 378.26±60 084.60)与BMP-2组(223 294.43±80 266.72)比较差异无统计学意义(P＞0.05);TGF-β3组诱导第7天OC表达的IOD值(109 568.82±14 079.88)高于BMP-2组(55 168.57±1 694.93)(P＜0.05),诱导第14天OC表达的IOD值(411 544.95±82 803.24)与BMP-2组(360 103.54±20 835.36)比较差异无统计学意义(P＞0.05);BMP-2组、TGF-β3组诱导第7天出现少量淡蓝色ALP阳性区,诱导第14天蓝色ALP阳性区增大且蓝染颜色加重,镜下观察2组无明显差异.结论 与BMP-2比较,TGF-β3对早期兔DPSCs向成骨细胞分化有较明显的促进作用.
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肝素促进转化生长因子-β3在体外诱导兔牙髓干细胞成骨向分化中的作用
目的 探讨转化生长因子(transforming growthfactor,TGF)-β3联合肝素在体外诱导兔牙髓干细胞(dental pulpstem cells,DPSCs)成骨向分化中的能力.方法 新西兰幼兔4只,采用酶解组织块法分离培养兔DPSCs,传代培养至第3代兔DPSCs,分为空白对照组、TGF-β3组和TGF-β3+肝素组;空白对照组正常培养,TGF-β3组在细胞培养基中加入20 μg/L TGF-β3,TGF-β3+肝素组在细胞培养基中同时加入20 μg/L TGF-β3和5 u/mL肝素.采用碱性磷酸酶(alkailine phosphate,ALP)试剂盒检测各组兔DPSCs成骨向诱导后第7、14天细胞内ALP活性,细胞爬片采用免疫细胞化学法检测成骨细胞标记物RUNT相关转录因子2(runt related transcription factor 2,RUNX-2)和骨钙素(osteocalcin,OC)表达情况,采用茜素红染色观察矿化结节形成情况.结果 兔DPSCs在诱导体系中生长状态良好;TGF-β3+肝素组第7、14天ALP活性[(27.20±1.01)、(29.06±1.39) u/(mg·pro)]高于TGF-β3组[(12.69±1.03)、(9.44±1.05)u/(mg· pro)]和对照组[(5.96±3.68)、(6.10±3.66)u/(mg·pro)](P＜0.01),TGF-β3组高于对照组(P＜0.01);TGF-β3组和TGF-β3+肝素组成骨诱导第7天RUNX-2开始出现阳性表达,第14天OC有阳性表达,对照组均为阴性;第21天茜素红染色对照组为阴性,TGF-β3组为阳性,TGF-β3+肝素组为强阳性.结论 肝素有促进TGF-β3体外诱导兔DPSCs成骨向分化的能力.
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富血小板血浆对骨髓间充质干细胞成骨向分化的作用
目的:观察不同浓度改良富血小板血浆(PRP)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨向分化的作用效果.方法:使用健康志愿者骨髓培养的3～4代BMSCs.将由该志愿者静脉采集的静脉血制备成改良PRP作用于BM-SCs,使用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒测定矿化诱导7d后BMSCs的ALP活性,通过茜素红染色观察矿化诱导21 d后BMSCs的矿化结节形成情况,并通过实时荧光定量PCR检测矿化诱导7d后BMSCs中成骨相关基因Runx2表达的变化.结果:5％改良PRP明显提高了BMSCs的ALP活性,促进了其矿化结节的形成,并上调了BMSCs中Runx2基因的表达.结论:液氮冻融激活的改良PRP促进BMSCs成骨向分化具有浓度特异性.
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自体浓缩生长因子对比格犬脂肪干细胞体外增殖及成骨向分化的影响
目的:分析自体浓缩生长因子(concentrated growth factor,CGF)对比格犬脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)体外增殖及成骨向分化的影响.方法:取健康比格犬脂肪组织进行分离、培养ADSCs并鉴定其多向分化潜能,细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞增殖.将ADSCs分为CGF组及对照组,对两组细胞进行成骨诱导后分别检测其碱性磷酸酶(ALP)活性,RT-PCR法检测I型胶原(Col-Ⅰ),Runx2等成骨相关基因表达.结果:CGF组细胞增殖能力明显高于对照组(P＜0.05);经成骨诱导的ADSCs在CGF作用下ALP活性明显增强(P＜0.05),Col-Ⅰ,Runx2等成骨相关基因的表达亦明显高于对照组(P＜0.05).结论:CGF能够促进ADSCs体外增殖和成骨向分化.
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不同管径钛纳米管对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响
目的 研究不同管径钛纳米管表面结构对体外培养SD大鼠骨髓间充质干细胞(rat mesenchymal stem cells,rMSCs)粘附、增殖及成骨向分化的影响.方法 分离并扩增rMSCs,成骨向诱导分化及流式细胞鉴定;阳极氧化法分别制备管径30、70、100 nm的TiO2纳米管,扫描电镜观察表面形貌、接触角测试材料表面亲疏水性;MTT法检测细胞在材料表面粘附及增殖情况,激光共聚焦显微镜观察细胞在材料表面形貌.评价细胞在纯钛,管径30、70、100 nm的TiO2纳米管表面成骨向分化过程中碱性磷酸酶活性变化特征及矿化情况.Real-time PCR检测诱导14 d后Runx2及OSX基因表达情况.结果 分离获得的rMSCs具有成骨向分化的能力,CD29阳性细胞为99.65％;扫描电镜观察各组材料表面管径均达到设计要求;管径为70 nm的TiO2纳米管材料表面亲水性较好(P＜0.05);MTT结果显示70 nm组rMSCs的粘附、增殖均较其他组明显增高(P＜0.05);30 nm组在成骨诱导7d后,碱性磷酸酶活性均高于其他组(P＜0.05).30 nm组在成骨诱导21 d后表面矿化高于其他组(P＜0.05).30 nm组在成骨诱导14 d后Runx2及OSX基因表达高于其余组(P＜0.05).结论 与光滑面纯钛相比,不同管径的TiO2纳米管对rMSCs的作用各不相同,rMSCs在70nm表面增殖能力和粘附性较好,但在30 nm表面的成骨向分化能力较强.
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Toll样受体2和4在细胞成骨向分化中的作用
Toll样受体（TLR）4是人类发现的第一个TLR相关蛋白质，主要介导格兰阴性细菌的免疫过程。TLR2具有相对广泛的配体特异性，可识别多种病原体相关分子模式，协助TLR4参与人体内对脂多糖的反应。研究显示， TLR2和TLR4参与多种细胞成骨向分化的调控。譬如TLR2和TLR4即可通过促进主动脉瓣间质细胞的成骨向分化参与主动脉瓣钙化过程，也可通过上调冠状动脉内皮细胞中骨形态发生蛋白2的表达参与冠状动脉粥样硬化，还可参与骨髓间质干细胞的成骨向分化。在牙髓组织中，有TLR4表达的成牙本质细胞样细胞可向成牙本质细胞受损处迁移并形成修复性牙本质；而TLR2和TLR4作为参与牙髓防御反应的成员，在牙髓组织受损时，不仅可调节炎症因子的表达，还参与牙髓细胞成牙本质向分化的调控。由此可见，TLR2和TLR4在细胞成骨向分化中的作用机制值得进一步的探讨。
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牙髓干细胞分化的研究进展
牙髓干细胞(DPSC)是一种具有高度增生、自我更新能力和多相分化潜能的成体干细胞,在一定条件下可向特定的细胞类型分化,在牙髓修复和牙齿再生中发挥着重要的作用.本文主要就DPSC 成骨向分化、成牙本质向分化的研究进展作一综述.
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机械牵张力促进小鼠骨髓间充质干细胞的成骨向分化
目的 旨在研究p38分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号通路和转录因子Osterix在间断性机械牵张力刺激下促进小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)成骨向分化的作用机制.方法 将C57BL/6J小鼠BMSC分为空白对照组、牵张力组和牵张力阻断组(p38MAPK通路抑制剂SB203580+牵张力),采用Flexercell体外细胞力学加载装置,施加频率为0.5 Hz、形变率为0.8％的牵张力,每天2次,每次30 min,分别在实验第1、3、5d收获BMSC.实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测成骨基因ALP、COLⅠ、OCN的mRNA水平变化情况,Western blot检测P-p38-MAPK蛋白的表达情况.通过小干扰核糖核酸(siRNA)技术沉默小鼠BMSC的osterix基因,Westem blot检测Osterix蛋白的表达情况,RT-PCR检测成骨相关基因ALP、COLⅠ、OCN的mRNA水平变化情况.结果 牵张力作用后,可观察到成骨相关基因ALP、COLⅠ、OCN及转录因子Osterix的mRNA水平增高.沉默osterix后,小鼠BMSC成骨相关基因ALP、COLⅠ、OCN的mRNA水平也随之降低.Western blot结果显示,牵张力组小鼠BMSC中Osterix和P-p38-MAPK的蛋白质水平明显高于对照组(P＜0.05).SB203580作用后,小鼠BMSC成骨相关基因ALP、COLⅠ、OCN和osterix的mRNA水平降低.结论 间断性牵张力可通过活化p38MAPK-Osterix通路促进小鼠BMSC成骨分化.
关键词： 间断性牵张力 骨髓间充质干细胞 成骨向分化 p38MAPK信号通路 -
Wnt 信号通路对牙齿发育和牙囊成骨向分化的调控作用
Wnt 信号通路包括经典 Wnt／β－catenin 信号通路和非经典通路，对个体组织发育和干细胞的自我更新具有重要调控作用，在包括颅面部器官在内的几乎所有器官发生过程中都必需 Wnt 信号通路的调控。研究发现，Wnt／β－catenin 信号通路不仅在牙齿发育过程中参与了上皮和间充质的相互作用，在牙囊细胞的分化过程亦有 Wnt 信号通路的参与。本文就 Wnt 信号通路在牙齿发育和牙囊成骨／成牙骨质向分化中的调控作用研究进展作一综述。
