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成纤维细胞与结肠癌细胞相互作用促进细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的表达
目的 研究成纤维细胞与结肠癌细胞相互作用对二者表达细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)的影响,初步探讨肿瘤-基质相互作用在结肠癌侵袭转移中的作用.方法 结肠癌SW480细胞与HELF成纤维细胞以RPMI 1640培养液分别共培养0、12、24、48 h,通过RT-PCR和免疫细胞化学方法检测SW480和HELF细胞中EMMPRIN的表达.结果 共培养组SW480细胞EMMPRIN mRNA和蛋白的表达均明显升高,HELF细胞本来不表达EMMPRIN,与SW480细胞共培养12、24、48 h后检测到EMMPRIN表达,且随时间延长而表达增加.结论 成纤维细胞与结肠癌细胞相互作用上调SW480细胞EMMPRIN的表达,并诱导HELF细胞表达EMMPRIN,有可能在结肠癌侵袭转移中发挥重要作用.
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转染Cx43人脐血源基质细胞对SUP-B15细胞增殖的影响
目的：探讨转染Cx43(Connexin 43)人脐血源基质细胞（hUCBDCs）对人急性淋巴细胞白血病细胞SUP-B15增殖的影响。方法重组腺病毒转染以上调人脐血源基质细胞Cx43表达，建立人脐血源基质细胞和SUP-B15细胞共培养模型，选取共培养72 h为时间点收集悬浮SUP-B15细胞，采用CCK-8检测SUP-B15细胞的增殖，流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期。结果人脐血源基质细胞抑制SUP-B15细胞增殖，转染 Cx43后人脐血源基质细胞的抑制作用更明显，两者比较差异具有统计学意义（P＜0.05）；转染Cx43人脐血源基质细胞对SUP-B15细胞凋亡率为（5.51±0.51）%；明显高于未转染组[（2.26±1.41）%]和阴性对照组[（2.97±1.58）%]（P＜0.05）。结论转染Cx43人脐血源基质细胞具有抑制SUP-B15细胞增殖、诱导凋亡的作用。
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体外共培养诱导骨髓间充质干细胞向胰岛样细胞分化
目的 观察成熟胰岛细胞对小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymalstem cells,mMSCs)的诱导分化作用,为胰岛细胞移植治疗糖尿病提供移植细胞来源.方法 采用贴壁法分离培养小鼠mMSCs,并传代扩增.应用共聚焦显微镜观察细胞形态,流式细胞仪分析其表面分子.经胆总管注入Ⅳ型胶原酶消化胰腺,行密度梯度离心获得胰岛细胞.运用Transwell共培养体系,取第3代mMSCs与胰岛细胞共培养,倒置显微镜观察细胞的生长及形态变化,细胞免疫化学法检测mMSCs胰岛素的表达,胰岛素释放试验检测胰岛素分泌.以单独培养mMSCs作为对照组.结果 从小鼠骨髓中获得的细胞培养48 h后呈长梭形,体积较大,1周后呈集落式生长,可传代培养.细胞表面分子Sca-1、CD29、CD44、CD105呈阳性,且表达水平较高,而CD34、CD45阴性,证实为mMSCs.与小鼠胰岛细胞共培养7 d后,部分mMSCs细胞胰岛素免疫组化染色呈阳性,胰岛素分泌量为(16.83±0.15)μIU/ml.结论 从小鼠骨髓中分离培养的mMSCs与胰岛细胞共培养后可以被诱导分化为胰岛样细胞,为在胰岛细胞移植治疗糖尿病中存在的供体缺乏和免疫排斥问题提供了新的解决方法 .
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酰基化Ghrelin在体外拮抗巨噬细胞介导的炎症反应对胰岛β细胞功能影响的研究
目的 采用Transwell小室构建的小鼠胰岛细胞株MIN6和巨噬细胞株RAW264.7共培养系统,探讨酰基化Ghrelin能否保护胰岛β细胞免遭巨噬细胞介导的炎症损伤. 方法 实验分为单独RAW264.7巨噬细胞组、单独MIN6胰岛细胞组、共培养组和Ghrelin干预组.RT-PCR和Western blot 检测巨噬细胞上Toll样受体4(TLR4)和脂肪酸结合蛋白(A-FABP)的表达;ELISA检测细胞上清液IL-1β、TNF-α的浓度,以及葡萄糖刺激后MIN6细胞上清液的胰岛素浓度. 结果 (1)共培养系统中,巨噬细胞TLR4[mRNA及蛋白水平分别为(1.35±0.13),(0.93±0.03)],A-FABP[(1.99±0.10)vs(0.91±o.01)]的表达],细胞上清液IL-1β[(10.47±1.11) pg/ml]、TNF-α[(917.54±9.09) pg/ml]蛋白水平较单独RAW264.7巨噬细胞组高(P＜0.05);(2)高糖刺激下,共培养系统中胰岛β细胞的胰岛素分泌水平较单独MIN6胰岛细胞组低(P＜0.05);(3)与共培养组比较,酰基化Ghrelin干预后共培养,巨噬细胞TLR4表达水平和TNF-α均降低(P＜0.05),且呈剂量依赖性,但胰岛β细胞的胰岛素分泌水平与共培养组比较,差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 巨噬细胞与胰岛β细胞共培养后,炎症通路活化,炎症因子释放,胰岛β细胞的胰岛素分泌功能受损;酰基化Ghrelin可剂量依赖性削弱巨噬细胞和胰岛β细胞共培养后炎症通路的活化和炎症因子的释放,但不能完全阻止胰岛β细胞胰岛素分泌功能的降低.
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不同来源软骨细胞共培养对骨髓间充质干细胞早期分化的影响
目的 了解不同来源的软骨细胞在细胞隔离共培养的环境中,对相同来源的骨髓间充质干细胞(MSCs)早期向软骨系分化的影响.方法 利用悬挂式细胞培养皿,将不同来源的软骨细胞(骨性关节炎患者的软骨细胞、正常成年人的软骨细胞、胎儿软骨细胞)及对照MSCs,和同一来源的MSCs隔离培养在同一培养液中,共享细胞培养液,分别在培养3d、6d、9d、12d通过显微镜观察,并应用Real time PCR技术测定经不同来源软骨细胞诱导的MSCs表达蛋白聚糖,Ⅱ型胶原(COL2),软骨转录调控因子(SOX-9)信号的水平.结果 MSCs在不同来源的软骨细胞诱导下,在细胞培养12d后,与对照组比较,出现了形态的明显区别.SOX-9的mRNA表达分别为对照组的1.7倍、1.6倍、1.2倍(P＜0.05);蛋白聚糖的mRNA表达分别为对照组的2.8倍、2.2倍、1.3倍(P＜0.05),COL2的mRNA表达变化不大;相应蛋白的信号水平变化表达也有较大差异,胎儿软骨细胞组相对于骨性关节炎患者的软骨细胞组及正常成年人的软骨细胞组更加明显.结论 隔离共培养体系能够通过局部微环境的调节,具有间接促进MSCs定向诱导分化成软骨细胞的作用,不同来源的软骨细胞促分化的影响不同,但都具有促MSCs定向诱导分化成软骨细胞的能力.
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软骨细胞与脂肪基质细胞共培养体外构建软骨的初步研究
目的 探讨软骨细胞与脂肪基质细胞(adipose-derived stromal cells,ADSCs)共培养体外构建软骨的可行性,并阐明软骨细胞提供的软骨微环境能否诱导ADSCs向软骨细胞分化并形成软骨组织.方法 分别培养扩增人ADSCs与猪耳软骨细胞,将2种细胞按7:3(ADSCs:软骨细胞)比例混匀,以5.0×107/ml的细胞终浓度接种于聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA,直径8 mm,高2 mm)支架作为共培养组,以相同终浓度的单纯软骨细胞和单纯ADSCs分别接种相同支架作为阳性对照组及阴性对照组,以30％上述浓度(1.5×107/ml)的单纯软骨细胞接种作为低浓度软骨细胞对照组.每组各接种6例标本,每例接种细胞悬液200μl.全部标本均于体外培养8周时取材,通过大体观察、组织学、免疫组化及湿重、蛋白多糖定量检测等方法对新生软骨进行初步评价.多样本t检验统计分析各组湿重及蛋白多糖含量差异.结果 各组细胞均与材料粘附良好.共培养组及阳性对照组体外培养8周时基本保持了复合物初始大小和形状,大体观察2组均形成了较成熟软骨组织,组织学显示大量软骨基质和软骨陷窝形成,免疫组化显示软骨特异性细胞外基质Ⅱ型胶原分泌.定量测定结果表明,共培养组的平均湿重为(174±12) mg,平均蛋白多糖含量为(7.6±0.4) mg,两者分别达到阳性对照组的75％ (P＜ 0.01)和79％ (P＜ 0.01).阴性对照组(单纯ADSCs组)明显皱缩变形,组织学未见成熟软骨陷窝.低浓度软骨细胞组明显变薄,新生软骨平均湿重为(85 ±5) mg,是阳性对照组的37％ (P＜ 0.01),只在局部形成了不连续的软骨组织.结论 软骨细胞与ADSCs共培养能够在体外构建较成熟的软骨组织,软骨细胞能够诱导ADSCs成软骨分化及体外形成软骨组织.
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人真皮间充质干细胞对增生性瘢痕成纤维细胞α-SMA和DCN表达的影响
目的 初步探讨人真皮间充质干细胞(human dermis derived mesenchymal stem cells, hDMSCs)对不同时期增生性瘢痕成纤维细胞(HSFB) α-平滑肌肌动蛋白(α smooth muscle actin,α-SMA)和核心蛋白多糖(decorin,DCN)表达的影响,以探讨间充质干细胞用于增生性瘢痕防治的可行性.方法 机械法联合酶消化法分离、培养hDMSCs,取第3代生长良好的细胞,以流式细胞仪检测hDMSCs的CD分子,免疫细胞化学检测角蛋白19和波形蛋白,向成脂、成软骨和成骨细胞诱导分化.根据临床上增生性瘢痕形成的病程将瘢痕标本分为6个月、1年、2年3组,每组3例.将3组HSFB分别与第3代生长良好的贴壁hDMSCs通过非接触式Transwell共培养体系培养21 d,并分别与相对应组HSFB普通6孔板培养21d进行对照,采用RT-PCR和Western Blot技术检测3组共培养后HSFB α-SMA和DCN的mRNA和蛋白的表达情况.结果 hDMSCs高表达CD73、CD105、CD44、CD90等间充质干细胞表面标志,不表达CD14、CD34、CD45等造血干细胞表面标志,波形蛋白阳性表达,不表达角蛋白19.经诱导可以向成脂、成软骨和成骨细胞分化,符合间充质干细胞的低鉴定标准.普通6孔板培养的6个月、1年、2年3组HSFB的α-SMA mRNA及蛋白的表达量分别为198.20±15.46、0.29±0.070,175.24±17.04、0.38 ±0.110,125.73 ±6.99、0.33±0.085:DCNmRNA及蛋白的表达量分别为61.30 ±9.79、0.015 ±0.003,70.89±11.29、0.020±0.007,77.31±4.80、0.023±0.003.与5×104 hDMSCs共培养处理后6个月、1年、2年3组HSFB0α-SMA mRNA及蛋白的表达量分别48.40±6.42、0.100±0.020,192.16±11.37、0.110±0.014,73.33 ±6.29、0.ll0±0.016;DCN mRNA及蛋白的表达量分别为156.92±14.91、0.049±0.015,154.42±18.17、0.033±0.008,140.82±7.32、0.030±0.004.与普通6孔板培养相比较,共培养各组HSFB的α-SMA mRNA及蛋白表达下调,DCN mRNA及蛋白表达上调,并以增生性瘢痕形成早期即6个月组变化较明显.结论 hDMSCs在体外培养体系中可下调HSFB α-SMA mRNA和蛋白的表达、上调DCN mRNA和蛋白的表达,并且对增生性瘢痕形成早期的成纤维细胞作用较明显,hDMSCs的抗纤维化作用有望用于提高创面愈合质量和病理性瘢痕的防治.
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卵巢上皮性癌淋巴结高转移细胞和脐静脉内皮细胞交互和共同培养后细胞特征的变化
目的：探讨卵巢上皮性癌（卵巢癌）淋巴结高转移细胞和脐静脉内皮细胞体外交互和共同培养后细胞特征的变化。方法建立绿色荧光蛋白（GFP）标记的卵巢癌淋巴结高转移细胞株SKOV3/PM4细胞和细胞膜红色荧光染料DiI标记的人脐静脉内皮细胞株HUVEC细胞，分别收集SKOV3/PM4、HUVEC细胞的培养上清液，作为交互培养的条件培养基（如以HUVEC细胞培养的上清液培养SKOV3/PM4细胞），建立两种细胞交互培养和共同培养体系。细胞交互培养后，光镜观察细胞形态的变化并计算细胞分裂指数，透射电镜观察细胞超微结构的变化，四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测细胞生长速度，流式细胞仪分析细胞周期比例；细胞共同培养后，激光共聚焦显微镜观察两种细胞间的相互作用情况，明胶酶谱法检测细胞中基质金属蛋白酶2（MMP-2）和MMP-9的表达。结果细胞交互培养后，与单独培养的SKOV3/PM4细胞相比，交互培养的SKOV3/PM4细胞伪足增多，核分裂象[细胞分裂指数分别为（4.8±0.8）%、（11.2±0.3）%；P<0.05]增多，生长速度明显增快，G0/G1期细胞比例[分别为（69.4±3.6）%、（48.4±4.6）%；P<0.05]降低，G2/M期细胞比例[分别为（5.2±1.6）%、（24.9±2.2）%；P<0.05]升高；与单独培养的HUVEC细胞相比，交互培养的HUVEC细胞形态改变明显，出现空泡化超微结构，核分裂象[细胞分裂指数分别为（2.7±0.5）%、（5.7±0.6）%；P<0.05]增多，生长速度略降低，G0/G1期细胞比例[分别为（51.4±2.2）%、（79.0±4.1）%；P<0.05]升高，G2/M期细胞比例[分别为（19.1±1.2）%、（3.3±0.5）%；P<0.05]降低。细胞共同培养48 h后，激光共聚焦显微镜观察，绿色荧光标记的SKOV3/PM4细胞和红色荧光标记的HUVEC细胞出现融合现象；明胶酶谱法检测显示，MMP-2在HUVEC细胞中不表达，在SKOV3/PM4细胞中低表达，在共同培养的SKOV3/PM4+HUVEC细胞中高表达，SKOV3/PM4+HUVEC细胞、SKOV3/PM4细胞中MMP-2的灰度值分别为1885±84和1209±114，两者比较，差异有统计学意义（P<0.05）；而MMP-9在HUVEC细胞、SKOV3/PM4细胞、SKOV3/PM4+HUVEC细胞均不表达。结论 SKOV3/PM4、HUVEC细胞交互培养、共同培养分别与单独培养相比，其细胞特征均发生明显改变，推测可能与细胞生长的微环境及细胞间相互作用有关。
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人脐带间充质干细胞诱导为牙周韧带样细胞的实验研究
目的 建立人牙周韧带细胞(human periodontal ligament cell,hPDLC)与人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell,hUCMSC)体外非接触式共培养模型,研究hUCMSC定向分化为hPDLC的可能性,探索新的可用于牙周组织工程的种子细胞.方法 利用跨室培养装置(Transwell)培养板建屯hPDLC与hUCMSC体外非接触式共培养模型,免疫组织化学方法 检测其骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨钙素(ostocalcin,OCN)及骨涎蛋白(bone sialopmtein,BSP)的表达情况,并采用蛋白质印迹法从蛋白水平定量分析诱导后hUCMSC在分子水平的改变.结果 hUCMSC在非接触式共培养体系中可以被hPDLC诱导为多角形或梭形,蛋白质印迹法检测结果 显示,共培养3、7、14及21 d后的hUCMSC在蛋白水平OCN和OPN表达上调[OCN共培养前(0.88±0.21),共培养21 d(1.42±0.17);OPN共培养前(0.93±0.13),共培养21 d(1.43±0.22)];BSP表达逐渐下调[共培养前(1.60±0.09),培养21 d(0.75±0.20)],与共培养前相比差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 hUCMSC在一定条件下可向hPDLC定向分化,并有望成为牙周组织工程的种子细胞.
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大鼠血管内皮祖细胞对骨髓间充质干细胞增殖及凋亡的影响
目的 探讨大鼠血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPC)对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)增殖及凋亡的影响,为促进BMSC再生能力提供理论依据.方法 体外分离、培养并鉴定大鼠EPC、BMSC.利用Transwell小室建立EPC、BMSC间接共培养体系,共培养组为BMSC-EPC共培养,对照组为BMSC-BMSC共培养;检测不同接种比例下(EPC:BMSC为1∶1、10∶1、100∶1)克隆集落形成率(colony forming unit-fibroblastic,CFU-F)的变化;采用流式细胞术检测间接共培养第3天,EPC对BMSC细胞周期的影响,以及共培养第3、7、10天,EPC对BMSC细胞凋亡的调控作用.用独立t检验进行两组比较,同组内不同时间点的细胞凋亡率以及不同接种比例的CFU-F比较采用单因素方差分析.结果 共培养组S期细胞比例[(15.72±2.93)％]显著高于对照组[(2.02 ±0.66)％](P＜0.01).不同接种比例下(10∶1、100∶1)共培养组CFU-F[(50.98±6.32)％、(57.87±14.06)％]也显著高于对照组[(33.07±9.60)％、(30.06±7.20)％,P＜0.0I].共培养第3、7、10天两组细胞凋亡率差异无统计学意义(P＞0.05).结论 EPC可通过细胞间接接触促进BMSC增殖,但对BMSC的凋亡没有明显影响.
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AG490对成骨细胞和破骨细胞之间相互作用的影响
目的 体外建立MC3T3-E1细胞与RAW 264.7细胞间接共培养体系,观察AG490对共培养体系中破骨细胞形成的影响.方法 MC3T3-E1细胞经矿化诱导培养后,与RAW 264.7细胞进行间接共培养,经一定浓度AG490(1、5、10μmol/L)分别处理后,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖,氮偶联法检测成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测成骨细胞相关基因骨保护素(OPG)、Ⅰ型胶原(COL1)、ALP、骨钙素(OCN)的表达,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和苏木素染色检测破骨细胞的形成,蛋白印迹法(Western blot)检测破骨细胞中RANK的表达.采用单因素方差分析和双因素方差分析对数据进行统计分析.结果 AG490下调MC3T3-E1细胞矿化过程中OPG、COL1、ALP、OCN mRNA的表达(FOPG=30.120,POPG,AG4901μmol/L=0.021、POPG,AG4905μmol/L=0.221、POPG,AG49010μmol/L=0.003;FALP=67.352,PALP,AG4901μmol/L=0.034、PALP,AG4905μmol/L=0.001、PALP,AG49010μmol/L=0.156;FCOL1=28.158,PCOL1,AG4901μmol/L=0.054、PCOL1,AG4905μmol/L=0.002、PCOL1,AG49010μmol/L=0.4;FOCN=125.375,POCN,AG4901μmol/L<0.001、POCN,AG4905μmol/L<0.001、POCN,AG49010μmol/L<0.001).与RAW264.7细胞单独培养作为对照组相比,MC3T3-E1细胞与RAW 264.7细胞间接共培养明显促进成熟破骨细胞的形成,AG490在这个过程中对破骨细胞的形成起到抑制作用(F=85.391,P共培养组-对照组<0.001,P共培养+AG490组-共培养组=0.035),同时与对照组相比,明显抑制破骨细胞中RANK蛋白的表达(FRANK=376.25,PRANK,AG4901μmol/L=0.468、PRANK,AG4905μmol/L=0.003、PRANK,AG49010μmol/L<0.001).结论 AG490抑制MC3T3-E1细胞成骨向分化,并通过影响OPG/RANKL/RANK信号轴的传递抑制成骨细胞与破骨前体细胞间接共培养过程中破骨细胞的形成.
关键词： 共同培养技术 核因子κB受体活化因子 AG490 成骨向分化 破骨向分化 -
非诺贝特对凝胶包埋培养的原代大鼠肝细胞的毒性
目的 研究非诺贝特对凝胶包埋培养的原代大鼠肝细胞内氧化压力和脂质含量的影响.方法 将收获得到的新鲜原代大鼠肝细胞进行胶原凝胶包埋,构建肝细胞体外凝胶包埋培养模型,同时构建传统平板模型作为对照.在肝细胞培养过程中加入非诺贝特25和100 μmol· L-1,分别于培养3和7d后,检测细胞内活性氧类(ROS)、丙二醛(MDA)、甘油三酯(TG)含量,并用尼罗红和油红O对细胞内中性脂滴进行定量分析和染色观察.结果 平板模型非诺贝特各组之间没有显著性差异,而凝胶包埋模型非诺贝特各组之间差异明显.对于凝胶包埋模型,非诺贝特25和100 μmol·L-1均导致细胞内ROS增加,其中非诺贝特处理3d组细胞内ROS分别为对照组的(131±19)%和(149±10)%,非诺贝特处理7d组细胞内ROS分别为正常对照组的(121±8)%和(117±5)%(P＜0.01)；非诺贝特还导致了胞内MDA含量、TG和中性脂含量的显著增加(P＜0.05).结论 凝胶包埋培养原代大鼠肝细胞作为体外培养模型相对于平板模型能更好地反映非诺贝特的肝毒性作用.
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细胞共培养技术的研究进展
目前,两种细胞之间的共培养方法包括直接共培养和间接共培养,而共培养体系主要用于诱导细胞向另一种细胞分化、诱导细胞自身的分化、维持细胞的功能和活力、对细胞增殖进行调控、促进早期胚胎的发育和提高代谢物的产量.目前细胞共培养体系主要用于药效方面的研究,而用于毒理学方面的研究却很少.但是,由于共培养体系缩短实验次数、减少药物使用量、辨别药物的优先毒性靶器官和研究药物代谢产物的毒性作用等优点,使之成为未来细胞毒理学研究发展的方向之一.本文就细胞共培养技术的方法进行综述,并对共培养体系研究的应用进行了概述.
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腺样囊性癌SACC-83细胞对雪旺氏细胞的促生长作用
目的:观察在体外共培养中腺样囊性癌细胞对由坐骨神经生长出的雪旺氏细胞的影响.方法:将腺样囊性癌细胞、舌癌细胞及成纤维细胞分别与小鼠坐骨神经共培养,制备细胞玻片并行S100免疫组化染色实验.结果:腺样囊性癌细胞可促进由坐骨神经长出的雪旺氏细胞增生;经S100免疫组化染色,阳性为雪旺细胞;阴性为成纤维细胞.结论:坐骨神经与腺样囊性癌细胞共培养可促进雪旺氏细胞增生.
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脂肪酸结合蛋白抑制剂在小鼠体外对胰岛β细胞遭受巨噬细胞介导的炎症损伤的保护作用
目的 探讨脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(A-FABP)抑制剂对胰岛β细胞遭受巨噬细胞介导的炎症损伤的保护作用.方法 采用Transwell小室构建小鼠胰岛细胞株MIN6和巨噬细胞株RAW264.7的共培养系统.在共培养前2h,在RAW264.7巨噬细胞中分别加入A-FABP的抑制剂(5μmol/L).共培养48 h后,用实时定量PCR和Western印迹法检测RAW264.7巨噬细胞上Toll样受体(TLR)4和脂肪酸结合蛋白(A-FABP)的表达,用ELISA方法检测细胞上清液中白细胞介素(IL-1)β和肿瘤坏死因子(TNF)-α的浓度,此外,用含葡萄糖3、30 mmol/L的碳酸氢钠缓冲液(KRBB液)孵育MIN6胰岛细胞1h,用ELISA方法测定细胞上清液中胰岛素的浓度.结果 (1)共培养后,巨噬细胞上TLR4和A-FABP的表达水平以及细胞上清液中IL-1β和TNF-α的浓度均明显高于巨噬细胞对照组(均P ＜0.05)；(2)共培养后,高糖刺激的胰岛素分泌水平明显低于胰岛细胞对照组[(16.0±2.2)比(41.1±6.6)ng/ml,P＜0.05]；A-FABP的抑制剂干预后再共培养,巨噬细胞上TLR4和A-FABP的表达水平以及细胞上清液中的IL-1β和TNF-α的浓度均显著低于共培养对照组(均P＜0.05),高糖刺激胰岛β细胞的胰岛素分泌水平显著高于共培养对照组[(31.4±3.3)比(16.0±2.2)ng/ml,P＜0.05].结论 (1)巨噬细胞与胰岛β细胞共培养后,可活化炎症通路,释放炎症因子,损伤胰岛β细胞的胰岛素分泌能力；(2) A-FA BP的抑制剂可抑制巨噬细胞和胰岛β细胞共培养后炎症通路的活化和炎症因子的释放,从而阻止胰岛β细胞胰岛素分泌能力的下降.
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骨髓间质干细胞和脂肪间质干细胞混合培养后的成骨能力
目的 探讨骨髓间质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSC)和脂肪间质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSC)混合培养后的成骨分化能力.方法 以贴壁法和酶消化法获得BMSC和ADSC,用流式细胞术鉴定细胞表型;对两种细胞进行成脂肪、成软骨、成骨诱导,分别以油红“O”染色、甲苯胺蓝染色、茜素红染色进行鉴定;碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、茜素红染色鉴定成骨分化.取第3代BMSC和ADSC细胞加入成骨诱导液,根据不同处理方法分为四组:BMSC未诱导组、BMSC成骨诱导组、ADSC成骨诱导组、BMSC+ADSC成骨诱导组.成骨诱导第1、3、5、7、9、11天检测ALP活性,第7、14、21、28天检测钙离子吸光度,第14天采用RT-PCR和Western Blot检测骨钙素(Osteocal-cin,OCN)、Runx2蛋白的表达.将BMSC、ADSC或BMSC+ADSC细胞植入羟基磷灰石/壳聚糖/聚乳酸(Hydroxylapatite/Chi-tosan/Poly L-latic acid,HMCS/PLLA)支架材料,植入大鼠下肢骨缺损模型,术后8周取材检测复合材料的新骨形成面积.结果 ADSC和BMSC两种细胞在成脂、成软骨、成骨诱导后染色均为阳性.诱导第1、3天,各组细胞ALP活性增加不明显,第5天以后活性开始明显增强,其中BMSC+ADSC组高于其他三组.诱导第7天,各组细胞钙离子吸光度无明显变化,第14天开始逐渐增高,其中BMSC+ADSC成骨诱导组高于其他三组.诱导第14天,BMSC+ADSC成骨诱导组OCN和Runx2基因表达(分别为78.24±8.11,1 180.13±121.16)和蛋白表达(分别为6.54±0.59,4.43±0.51)较其他三组升高,差异有统计学意义(P＜0.05).材料植入体内8周后,BMSC+ADSC组有大量板状骨形成,支架材料基本降解完全,新骨形成面积为(497.75±7.44)μm2,明显大于其他三组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 BMSC与ADSC两种细胞混合培养较单一细胞的体内和体外成骨能力增强.
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人脐带间充质干细胞和大鼠激活态雪旺细胞联合培养的实验研究
目的:探讨体外分层共培养条件下大鼠激活态雪旺细胞对人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)生长及分化的影响.方法:分离、培养人脐带间充质干细胞和大鼠激活态雪旺细胞,通过Millicell小室实现两者体外共培养,根据共培养与否分为共培养组与对照组,通过巢蛋白(Nestin)、神经丝蛋白200(NF200)免疫荧光染色分析干细胞分化情况.结果:共培养组两种细胞在Millicell小室分层共培养条件下,hUCMSCs逐渐出现类似神经细胞的形态,对照组形态无明显变化.共培养组中hUCMSCs表达神经干细胞标志物Nestin,共培养1d后逐渐降低,而对照组仅低表达Nestin,共培养8h～7d,两组间差异有统计学意义(P＜0.01)；共培养组细胞共培养1d后hUCMSCs表达神经元标志物NF200,而对照组始终不表达NF200.结论:人脐带间充质干细胞有向神经细胞分化的能力,分层培养条件下大鼠激活态雪旺细胞可促进其神经方向分化.
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骨髓间充质干细胞旁分泌HGF体外调控肝星状细胞
目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)与肝星状细胞(HSCs)体外共培养体系中,BMSCs旁分泌肝细胞生长因子(HGF)对HSCs增殖、凋亡、活化的影响.方法 全骨髓贴壁法分离、培养、纯化大鼠BMSCs,另培养HSCs.6孔板半透膜建立上下两层细胞非直接接触共培养体系,实验设H组(HSCs单独培养)、H-H组(HSCs与HSCs共培养)、M-H组(BMSCs与HSCs共培养)、M-H-C组(BMSCs与HSCs共培养并加c-met抑制剂),各组细胞培养48 h后,流式细胞仪鉴定BMSCs,检测HSCs凋亡率,MTT法检测HSCs的增殖,免疫荧光共聚焦定量检测HSCs中α-肌动蛋白(α-SMA)的表达量,ELISA法检测共培养体系上清液中HGF的浓度.结果 MSCs高表达阳性表面分子CD29、CD90,低表达造血细胞表面标记CD45;BMSCs能明显抑制HSCs的增殖、活化并促进其凋亡,且M-H组上清液中HGF的浓度明显高于其他组.结论 BMSCs与HSCs共培养过程中,BMSCs通过旁分泌HGF促进HSCs的凋亡,抑制HSCs的增殖、活化.
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许旺细胞与脱细胞神经移植物共培养在周围神经损伤修复中的作用
目的:观察体外分离、培养、纯化的许旺细胞对脱细胞神经移植物修复神经损伤的促进作用,为临床应用组织工程化神经修复周围神经缺损提供实验依据.方法:实验于2004-04/2005-04在中国医科大学组织工程实验室完成.纳入普通级雄性Wistar大鼠24只,体质量180～220 g.随机分为实验组、空白对照组、自体移植对照组共3组,每组8只.分笼饲养.另纳入5～8 d龄Sprague-Dawley乳鼠40只,取其双侧坐骨神经与臂丛神经.实验组大鼠右后腿用种植许旺细胞的ARSN桥接人为造成的神经缺损.空白对照组大鼠右后腿用单纯ARSN桥接人为造成的神经缺损.酶反复消化法与差速贴壁法分离和培养许旺细胞;许旺细胞与10 mm长的脱细胞神经移植物共培养后,应用外科手术移植到大鼠坐骨神经缺损处,自体移植对照组大鼠右后腿用单纯切断的神经上下颠倒原位桥接人为造成的神经缺损.13周取材通过透射电镜和扫描电镜观察神经纤维的再生情况.结果:Wistar大鼠24只全部进入结果分析,没有脱失.①实验组较空白对照组的再生有髓神经纤维均匀,轴索略粗,髓鞘厚度有差别,部分神经纤维髓鞘还未形成板层结构,许旺细胞包绕神经纤维,轴索内微丝微管结构较清晰,无髓神经纤维直径较小,不均匀分布在有髓神经纤维之间,由一层纤维结缔包裹形成纤维束,实验组较自体移植对照组的髓鞘略薄,自体移植组再生神经纤维均较粗,许旺细胞包裹轴突形成排列规则、电子密度较高的髓鞘,髓鞘厚薄基本相同.②实验组可见大量许旺细胞呈双极梭形,并且首尾相连排列成链状或网状特征性分布.许旺细胞还可在神经纤维上的胶原丝上附着.③实验组有髓神经纤维数、髓鞘厚度、G率(有髓纤维总面积/神经于总面积)接近自体移植对照组,差异无显著性意义[(5 344±592),(5 514±373);(3.13±0.16),(3.19±0.25) μm;(48.43±3.62)%,(57.11±2.28)%;P＞0.05];与空白对照组比较差异有显著性意义[(5 344±592),(3 191±236);(3.13±0.16),(1.28±0.33)μm;(48.43±3.62)%,(31.05±4.19)%;P＜0.05].结论:与许旺细胞共培养的脱细胞神经移植物可加快宿主轴索再生,促进神经损伤修复,是临床修复神经缺损的可行办法.
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骨髓单核细胞和骨髓基质干细胞联合诱导破骨细胞样细胞
目的 探讨骨髓单核细胞向破骨细胞前体细胞分化的体外诱导条件.方法 4种方法诱导破骨细胞样细胞:(A)单纯骨髓单核细胞法,(B)单纯骨髓单核细胞+诱导培养液法,(C)骨髓单核细胞+BMSC共培养(1:1)法,(D)骨髓单核细胞+BMSC共培养(10∶1)法,通过抗酒石酸酸性磷酸酶活性(StrACP)测试、TRAP染色评估培养的细胞.结果 (B)和(D)接种法能获得破骨细胞样细胞,(D)法得到的破骨细胞样细胞活性高、数目多.结论 (D)法诱导破骨细胞优于其它培养法.
