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瞬时受体电位M7通道与血小板源性生长因子和5-HT促进大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖相关性的研究
目的：探讨瞬时受体电位M7通道（transient receptor potential melastatin 7，TRPM7）在血小板源性生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）和5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）诱导的肺动脉平滑肌细胞（pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs）异常增殖中的作用。方法：利用贴块法和酶解法分离大鼠PASMCs。采用RT-PCR、Western blot和全细胞膜片钳技术观察TRPM7在PASMCs中的功能性表达。利用TRPM7阻断剂2-APB，采用MTT的方法检测TRPM7对PDGF和5-HT诱导的PASMCs异常增殖的作用。结果：RT-PCR、Western blot结果显示，TRPM7在大鼠PASMCs中有mRNA和蛋白表达。利用膜片钳技术检测到TRPM7电流，且PDGF可上调TRPM7内、外向电流。100μmol·L-12-APB可抑制PDGF和5-HT引起的大鼠PASMCs异常增殖。结论：TRPM7可能参与PDGF和5-HT诱导的大鼠PASMCs的增殖，有可能成为肺动脉高压临床治疗的新靶点。
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缺血性脑卒中与瞬时受体电位M7通道的研究进展
缺血性脑卒中是临床上的常见病、多发病，且严重危害人类健康。钙离子和镁离子对缺血性脑卒中的发生、发展有很大的影响。位于细胞膜上的瞬时受体电位(TRP)M7(TRPM7)通道是镁、钙等阳离子的主要离子通道，可能与缺血性脑卒中存在很大的关联。TRPM7通道的研究将为缺血性脑卒中脑损伤的治疗及预防提供新靶点。
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TRPM7在肾脏缺血再灌注损伤中的表达变化
目的:瞬时受体电位M7(transient receptor potential melastatin 7,TRPM7)为1种具有离子通道和激酶特性的双功能膜蛋白,在缺血再灌注损伤中发挥重要的作用,但TRPM7在肾脏缺血再灌注损伤中的变化和作用尚不完全清楚.本研究探讨TRPM7在体内和体外肾脏缺血再灌注损伤模型中的变化.方法:建立体外肾小管上皮细胞TCMK-1不同方式的缺氧复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)模型,包括物理H/R(1％O2)以及CoCl2化学H/R模型,并建立体内小鼠肾脏缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion,I/R)模型.采用实时聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)方式检测H/R以及I/R不同时间点细胞或组织中TRPM7 mRNA或蛋白的表达变化.结果:TCMK-1细胞物理H/R模型中TRPM7 mRNA表达在再灌注24 h达到高;而在化学H/R模型中,TRPM7 mRNA表达在再灌注12h达到高;TCMK-1细胞物理H/R模型中,TRPM7蛋白含量在再灌注24 h达到高.在体内肾脏I/R模型中,TRPM7 mRNA在再灌注5d达到高.结论:TRPM7在肾脏I/R损伤过程中起重要的作用,提示TRPM7可能是肾脏I/R损伤过程中的一个潜在的治疗靶点.
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瞬时受体电位M7在地塞米松诱导的小梁细胞骨架蛋白重塑中的作用
目的 探讨瞬时受体电位M7(TRPM7)在地塞米松诱导的小梁细胞骨架重塑中的作用.方法 采用人小梁细胞株进行体外培养,第3～6代小梁细胞用于实验.采用免疫荧光检测技术对TRPM7在小梁细胞中的表达进行定位.在细胞培养基中加入0.2 mg地塞米松处理小梁细胞4d,终浓度分别为1×10-5、1×10-6和1×10-7 mol/L,采用Western blot法检测细胞中TRPM7蛋白在细胞中的表达量.将培养的小梁细胞分为正常对照组、siRNA转染组、TRPM7-siRNA1转染组和TRPM7-siRNA2转染组,采用Western blot法检测细胞中TRPM7和p-cofilin相对蛋白表达量.将培养的细胞分为正常对照组、TRPM7-siRNA转染组、地塞米松处理组和TRPM7-siRNA转染+地塞米松组,采用免疫荧光技术法观察各组细胞中细胞骨架蛋白Phalloidin和黏着斑蛋白Vinculin的表达.将培养的细胞分为正常对照组、地塞米松处理组、siRNA转染组、TRPM7-siRNA转染组、TRPM7抑制剂2-APB处理组和钙离子螯合剂EGTA处理组,采用免疫荧光技术测定各组细胞内钙离子荧光强度变化. 结果 TRPM7主要分布于小梁细胞的细胞膜,TRPM7蛋白相对表达量随着地塞米松剂量的增加而逐渐下降,组间总体比较差异有统计学意义(F=4.210,P＜0.05),1×10-5 mol/L地塞米松组细胞中TRPM7蛋白表达量明显低于正常对照组,差异有统计学意义(P=0.011).与正常对照组和siRNA转染组比较,TRPM7-siRNA1组和TRPM7-siRNA2组细胞中TRPM7蛋白相对表达量均明显降低,差异均有统计学意义(均P＜0.05).倒置显微镜下可见地塞米松处理组和TRPM7-siRNA转染组细胞突起减少,细胞体稍变大.免疫荧光法显示地塞米松处理组小梁细胞骨架张力纤维和黏着斑蛋白增多,TRPM7-siRNA转染组细胞中张力纤维变少、变细.与正常对照组和siRNA转染组比较,地塞米松处理组和TRPM7-siRNA转染组细胞内钙离子荧光强度变弱.Western blot检测显示,TRPM7-siRNA转染组细胞中p-confilin蛋白相对表达量明显低于siRNA转染组(0.317±0.031 vs.0.092±0.071),差异有统计学意义(t=5.030,P=0.007). 结论 高剂量地塞米松作用后可导致小梁细胞中TRPM7蛋白表达量下调,TRPM7蛋白下调可能通过使小梁细胞骨架微丝蛋白解聚和细胞内钙离子浓度的降低而参与地塞米松诱导的小梁细胞中细胞骨架的重塑.
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TRPM7对dHL-60细胞极性化的影响
目的 探讨瞬时受体电位M7 (transient receptor potential melastatin 7,TRPM7)对dHL-60细胞极性化的影响及可能的分子机制.方法 通过siRNA技术下调dHL-60细胞TRPM7蛋白表达,分为转染无义干扰片段的对照组和TRPM7干扰组,用Zigmond小室观察细胞极性化的变化,采用Western blot检测TRPM7和磷酸化AKT的表达,并用细胞免疫荧光方法观察磷酸化AKT的定位情况.结果 与转染无义干扰片段的对照组相比,转染TRPM7靶向siRNA的dHL-60细胞中,TRPM7蛋白表达水平明显降低(P＜0.05)；干扰TRPM7后dHL-60细胞的极性化率与对照组相比显著增加(P＜0.05)；磷酸化AKT表达明显上调,并从细胞质转向了细胞膜,呈极性分布在细胞质膜上,而总AKT的表达则无明显变化.AKT的特异性抑制剂Triciribine可使dHL-60细胞在fMLP刺激下的磷酸化AKT的极性分布消失.结论 TRPM7通过AKT信号通路调控细胞极性相关分子,进而影响dHL-60细胞的极性化能力.
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低强度聚焦超声通过瞬时受体电位M7促进骨髓间充质干细胞成骨分化
目的 探讨瞬时受体电位M7(transient receptor potential melastatin 7,Trpm7)在低强度聚焦超声(low-intensity pulsed ultrasound,LIPUS)促进骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)成骨分化中的作用及其机制.方法 分离培养小鼠BMSCs,流式细胞检测其特异性表面标志,茜素红和油红O染色检测其分化能力.碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性读数筛选LIPUS作用时间.ALP和茜素红染色观察LIPUS处理后促进成骨分化的能力,qPCR检测Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨钙素(osteocalcin,OCN)mRNA水平表达的变化,并检测LIPUS处理后24、48、72 h Trpm7 mRNA水平表达的差异.进一步分为对照组(LIPUS未处理组)、LIPUS处理组、LIPUS+二甲基亚砜(DMSO)组和LIPUS+ Trpm7抑制剂2-氨乙基硼酸二苯酯(2-APB)组,ALP活性读数、ALP染色和茜素红染色评价成骨分化能力,Western blot检测Trpm7和OPN、Runx2的蛋白表达.结果 体外培养获得BMSCs,与未处理组比较,LIPUS作用2 rain组细胞ALP活性读数升高为明显,LIPUS处理后细胞的ALP染色和茜素红染色明显增强,成骨分化相关基因OPN、OCN、RUNX2 mRNA表达明显增加(P＜0.05),LIPUS处理1、2、3d后Trpm7 mRNA表达显著增加(P＜0.05).LIPUS+ 2-APB组的ALP活性较LIPUS组和LIPUS+ DMSO组明显降低(P＜0.05).与对照组比较,LIPUS组和LIPUS+ DMSO组的ALP染色和茜素红染色显示成骨分化明显增加,Trpm7、OPN和Runx2的蛋白表达也明显增强.与LIPUS+DMSO组比较,LIPUS+2-APB组的ALP染色和茜素红染色显示成骨分化明显下降,Trpm7、OPN和Runx2的蛋白表达也明显降低.结论 LIPUS促进BMSCs的成骨分化,并部分通过Trpm7发挥作用.
