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纳米二氧化钛染毒对大鼠脑皮层细胞内钙离子浓度和钙蛋白酶1表达的影响
目的 研究纳米二氧化钛染毒对大鼠脑皮层细胞内钙离了浓度([Ca2+]i)和钙蛋白酶1(calpain 1)表达的影响.方法 将50只健康SPF级雄性Wistar大鼠随机分为5组,分别为对照(蒸馏水)组和低(62.5 mg/kg)、中(125 mg/kg)和高(250mg/kg)剂量纳米二氧化钛染毒组及微米二氧化钛(250 mg/kg)染毒组,每组10只.采用灌胃方式进行染毒,每天1次,连续染毒60 d,测定大鼠脑皮层细胞内[Ca2+]和calpain 1的表达水平.结果 与对照组比较,仅高剂量纳米二氧化钛染毒组大鼠脑皮层细胞内[Ca2+]i升高,差异有统计学意义(P＜0.05);而低、中剂量纳米二氧化钛及微米二氧化钛染毒组大鼠脑皮层细胞内[Ca2+]i略有升高趋势,但差异均无统计学意义(P≥0.05).且随着纳米二氧化钛染毒剂量的升高,大鼠脑皮层细胞内[Ca2+]呈上升趋势.与对照组比较,纳米二氧化钛及微米二氧化钛染毒组大鼠腋皮层组织calpain 1表达水平略有升高趋势,但差异均无统计学意义(P≥0.05).结论 在本实验剂量下,纳米二氧化钛染毒可导致大鼠脑皮层细胞内[Ca2+]i升高,但并未影响calpain 1的表达.
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丁苯酞对急性重度CO中毒大鼠海马区calpain1和CaMKⅡ蛋白表达的影响
目的 探讨丁苯酞(NBP)对急性重度一氧化碳(CO)中毒大鼠认知功能障碍的治疗作用及其机制.方法 按随机数字表法将120只健康雄性SD大鼠分为正常对照组、CO中毒组和NBP治疗组,每组40只.采用高压氧舱法建立急性重度CO中毒动物模型(吸入体积分数为1000×10-6的CO 40 min,继而吸入3000×10-6的CO 20 min),并给予高压氧舱治疗1.5h、每日1次,直至处死.NBP治疗组于染毒后2h灌胃NBP 60 mg/kg、每日2次,直至处死;正常对照组和CO中毒组灌胃等量纯橄榄油.各组分别于染毒后1、3、7、14、30 d取4只大鼠,采用Morris水迷宫实验进行认知功能评分,透射电镜下观察大鼠海马组织超微结构改变,用免疫荧光染色法检测脑组织海马区钙蛋白酶1(calpain 1)和钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)蛋白表达,用免疫荧光双标染色观察两种蛋白在神经细胞中的定位关系.结果 与正常对照组比较,CO中毒组染毒后1 d大鼠逃避潜伏期明显延长(s:55.6±3.2比44.5±3.5,P<0.05), 跨越平台次数明显减少(次:1.3±0.8比6.6±1.2,P<0.05);海马区神经细胞超微结构严重损坏;染毒后1 d脑组织calpain 1和CaMKⅡ蛋白表达(A值)即明显增高(calpain 1: 41.24±5.21比6.44±1.13, CaMKⅡ: 56.19±5.04比9.84±1.53,均P<0.05);calpain 1蛋白表达于3 d达峰值(59.34±6.11),CaMKⅡ蛋白表达于1 d达峰值(56.19±5.04).与CO中毒组比较,NBP治疗组在染毒后期(7~30 d)认知功能明显改善〔逃避潜伏期(s):7 d为40.3±1.9比49.1±3.1, 30 d为30.1±2.9比39.4±3.1; 跨越平台次数(次):14 d为2.8±1.0比1.0±0.9, 30 d为3.2±0.8比1.0±0.9,均P<0.05〕;海马神经元损伤程度相对轻微;染毒后脑组织calpain 1和CaMKⅡ蛋白表达均较CO中毒组明显降低(3 d时calpain 1蛋白为39.63±3.03比59.34±6.11,P<0.05;1 d时CaMKⅡ蛋白为42.22±3.84比56.19±5.04,P<0.05).免疫荧光双标染色提示,calpain 1和CaMKⅡ蛋白不仅可以在同一细胞共存,也可以在不同细胞中单独表达.线性回归分析显示,calpain 1与CaMKⅡ蛋白表达呈明显正相关性(R 2=0.852,P=0.002).结论 NBP能够通过修复海马超微结构损伤,恢复其完整性,均衡calpain 1和CaMKⅡ蛋白表达,从而改善急性重度CO中毒大鼠的认知功能,对海马损伤起到积极的保护作用.
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大鼠下丘神经元钙蛋白酶1表达与水杨酸钠所致听力损害的关系
目的：探讨下丘神经元钙蛋白酶1表达与水杨酸钠所致听力损害发生的关系。方法将36只健康SD大鼠随机分为水杨酸钠组及对照组，每组18只。水杨酸钠组腹腔注射水杨酸钠350 mg／kg（50 mg／mL），对照组腹腔注射等量生理盐水，均连续注射28天。分别于注射前1天、注射1周及注射4周行听性脑干反应测量两组听力阈值，Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ波潜伏期以及Ⅰ～Ⅴ、Ⅲ～Ⅴ波间潜伏期。采用免疫组织化学法检测两组下丘神经元钙蛋白酶1表达。结果与对照组比较，水杨酸钠组听力阈值增大，Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ波潜伏期及Ⅰ～Ⅴ、Ⅲ～Ⅴ波间潜伏期延长；下丘神经元钙蛋白酶1相对表达量增加（P均＜0．01）；随用药时间延长上述指标变化更为明显（P均＜0．05）。结论钙蛋白酶1参与了水杨酸钠导致听力损伤的过程；钙蛋白酶1在下丘神经元表达量可反映听力损伤程度。
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雷帕霉素对缺血再灌注损伤大鼠视网膜组织结构、内层厚度的影响及其机制
目的 观察雷帕霉素对缺血再灌注损伤(RIRI)大鼠视网膜组织结构、内层厚度的影响,并探讨其机制.方法 将65只健康成年SD大鼠随机分为对照组5只、模型组30只和观察组30只.模型组和观察组采用前房灌注法制备RIRI大鼠模型,观察组大鼠造模前2 h腹腔注射雷帕霉素(2 mg/kg),模型组大鼠腹腔注射等量的生理盐水.对照组不作任何处理.造模后0、2、6、12、24、48 h模型组、治疗组分别处死5只大鼠,对照组5只大鼠实验结束后处死,摘除眼球制成石蜡切片.HE染色光镜下观察各组大鼠视网膜组织形态,测量视网膜内层厚度;用免疫组化法检测各组大鼠视网膜组织中的Caspase-7、Calpain-1表达的平均光密度(AOD).结果 模型组大鼠造模后早期视网膜水肿增厚,晚期各层细胞排列疏松,视网膜神经节细胞数目减少,发生空泡样变性.观察组大鼠视网膜损伤程度和视网膜神经节细胞空泡变性程度均低于模型组相同时点.造模后0、2 h观察组视网膜内层厚度小于模型组(P均<0.05),造模后6、12、24、48 h观察组大鼠视网膜内层厚度大于模型组(P均<0.05).造模后各时点观察组视网膜组织Caspase-7、 Calpain-1的AOD均低于模型组相同时点(P均<0.05),但均高于对照组(P均<0.05).结论 雷帕霉素可以减轻RIRI大鼠视网膜损伤程度,其机制可能与其降低视网膜组织Caspase-7、Calpain-1表达有关.
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高尿酸通过激活钙蛋白酶加重缺血／缺氧条件下小鼠心肌细胞凋亡
目的:研究高尿酸对缺血/缺氧条件下心肌细胞的影响及钙蛋白酶(Calpains)在其中的作用.方法:将小鼠心肌细胞系分为3组:0 μmol/L尿酸+缺血/缺氧组(单纯缺血/缺氧组);600 μmol/L尿酸+缺血/缺氧组;1 200 μmol/L尿酸+缺血/缺氧组,通过流式细胞技术检测各组心肌细胞凋亡比例,并进一步将凋亡比例明显增加的实验组分为:1 200 μmol/L尿酸+缺血缺氧组;MDL28170+1 200 μmol/L尿酸+缺血缺氧组.采用DHE染色法与ELISA试剂盒测定心肌细胞中活性氧簇(ROS)水平,q-PCR法及Western blot检测心肌细胞中Calpain1、Calpain2、Calpastatin的表达情况.结果:高尿酸可明显增加缺血/缺氧状态下心肌细胞凋亡水平(P＜0.05).与单纯缺血/缺氧组相比,高尿酸显著增加了Calpain1/2的表达,明显抑制了Calpastatin的表达(P＜0.05),同时显著增加了心肌细胞中ROS的水平(P＜0.05),而在加入MDL28170干预后,心肌细胞的ROS水平及凋亡比例均有所降低(P＜0.05).结论:高尿酸通过激活Calpain所介导的氧化应激反应加重缺血/缺氧状态下心肌细胞凋亡.
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siRNA沉默钙蛋白酶1对胆囊癌细胞增殖和迁移的影响
目的:探究siRNA沉默钙蛋白酶1(Calpain1,CAPN1)对胆囊癌细胞GBC-SD增殖和迁移的影响及其潜在的分子机制.方法:将阴性siRNA、CAPN1-siRNA分别转染至细胞GBC-SD,以未转染的细胞为对照组,转染48 h后,采用荧光倒置显微镜检测转染效率,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测GBC-SD细胞中CAPN1的表达情况,应用MTT实验检测GBC-SD细胞增殖能力,采用划痕实验检测GBC-SD细胞迁移能力,采用蛋白免疫印迹(Western blot)检测GBC-SD细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)和CD44蛋白表达情况.结果:显微镜检测结果显示转染效率达到90％以上;与对照组、siRNA组相比,CAPN1-siRNA组细胞增殖率和迁移能力显著降低,CAPN1、PCNA、CD44蛋白表达显著降低(P<0.05).结论:siRNA沉默CAPN1具有一定的抑制胆囊癌细胞增殖和迁移作用,可为胆囊癌的治疗提供新的实验证据.
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不同浓度白头翁皂苷对口腔鳞癌细胞增殖、迁移和钙蛋白酶1、E-cadherin、N-cadherin蛋白的影响
目的:探究白头翁皂苷对口腔鳞癌细胞增殖、迁移及钙蛋白酶1(calpain1)表达的影响.方法:用0,1. 0,2. 0,4. 0,8. 0, 12. 0 mg·L-1白头翁皂苷处理人口腔鳞癌CAL27细胞.四甲基偶氮唑(MTT)法检测白头翁皂苷对CAL27细胞增殖的影响;细胞划痕实验与Transwell实验检测白头翁皂苷对CAL27细胞迁移与侵袭能力的影响;蛋白质印迹(Western blot)技术检测CAL27细胞calpain1、E-cadherin、N-cadherin蛋白的表达变化.结果:与空白对照组比较,白头翁皂苷对CAL27细胞的增殖抑制率显著增加(P<0. 05),且具有时间-剂量依赖关系. 12. 0 mg·L-1白头翁皂苷处理48 h后CAL27细胞细胞形态从长梭形间质样变成鹅卵石状上皮样.随着白头翁皂苷处理浓度的增加,CAL27细胞迁移与侵袭能力逐渐减弱(P<0. 05);CAL27细胞中calpain1、N-cadherin蛋白表达水平逐渐降低(P<0. 05),E-cadherin蛋白表达水平逐渐升高(P>0. 05).结论: 白头翁皂苷可抑制口腔鳞癌CAL27细胞增殖、迁移与侵袭过程,其机制可能与calpain1、N-cadherin表达下调、E-cadherin表达上调有关.
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CAPN1对胆囊癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响
目的 检测钙蛋白酶1(CAPN1)在胆囊癌(GBC)组织中的表达水平,探究其对人GBC细胞系(GBC-SD)增殖、侵袭及转移的影响.方法 采用免疫组化法检测GBC组织、癌旁组织、正常胆囊组织中CAPN1蛋白表达水平,分析其与GBC患者临床病理参数的关系.体外培养GBC-SD细胞和正常胆囊上皮细胞,将GBC-SD细胞分为CAPN1-siRNA组、阴性对照组和空白对照组,病毒感染72 h后,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(WB)技术检测细胞中CAPN1 mRNA及蛋白表达水平,CKK-8法检测细胞增殖情况,Transwell实验检测细胞迁移、侵袭能力.结果 GBC组织、癌旁组织、正常组织中CAPN1阳性表达率比较,差异有统计学意义(P＜0.05).不同TNM分期、病理分化和有无远处转移的GBC患者CAPN1阳性表达率比较,差异有统计学意义(P＜0.05).GBC-SD细胞中CAPN1 mRNA及蛋白水平显著高于正常胆囊上皮细胞(P＜0.05),感染CAPN1-siRNA后,GBC-SD细胞中CAPN1 mRNA及蛋白表达显著下调(P＜0.05).与空白及阴性对照组比较,siRNA组GBC-SD细胞的增殖、迁移、侵袭能力均显著下降(P＜0.05).结论 CAPN1在GBC组织中高表达,CAPN1沉默可抑制GBC细胞的增殖、迁移及侵袭,可能作为潜在生物靶标应用于GBC基因治疗.
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熊果酸对顺铂所致耳毒小鼠耳蜗3-NT及calpain 1表达的影响
目的:观察熊果酸对顺铂致毒小鼠耳蜗3-硝基酪氨酸及钙蛋白酶1表达的影响,探究熊果酸对顺铂引起的耳毒性的防护作用及其机制.方法:选用5周龄健康BALB/c小鼠,随机分成对照组、熊果酸组(80 mg/kg)、顺铂组(4.5 mg/kg)及顺铂(4.5mg/kg)联合熊果酸(80 mg/kg)组.各组动物均连续腹腔注射给药5天,每天1次.应用Western blot技术及显微图像分析观察小鼠耳蜗中3-硝基酪氨酸和钙蛋白酶1的表达,并结合听脑干反应(ABR)检测并观察用药前后小鼠听阈的改变.此外,采用Huo-3/AM染色法检测小鼠耳蜗内Ca2+的浓度改变.结果:熊果酸(80 mg/kg)联合顺铂小鼠听脑干反应阈移和耳蜗内Ca2+浓度的升高以及耳蜗3-硝基酪氨酸和钙蛋白酶1的表达均明显低于顺铂组.结论:熊果酸(80 mg/kg)可通过显著抑制顺铂所致3-硝基酪氨酸、钙蛋白酶1的高表达以及细胞内Ca2浓度的升高,从而有效拮抗顺铂的耳毒性,改善听功能.
