首页 > 文献资料
-
TGM1基因表达沉默对角质形成细胞细胞周期及相关蛋白表达的影响
目的：观察转谷氨酰胺酶1基因（ TGM1）表达沉默前、后对角质形成细胞的细胞周期及细胞周期相关蛋白表达的影响，探讨其机制。方法利用流式细胞仪（ FCM ）检测 RNA 干扰（ RNAi）技术沉默TGM1基因表达前、后人永生化角质形成细胞（ HaCaT细胞）的细胞周期状况；应用免疫细胞化学SP 法和Western 印迹法检测RNAi 技术沉默 TGM1基因表达前、后细胞周期蛋白（cyclin）D1、cyclin B1、细胞周期蛋白依赖激酶4（CDK4）的表达差异。结果 TGM1基因沉默后，小干扰RNA（ siRNA）－TGM1转染组处于 G0／G1期的细胞数（78．27％±1．83％）明显高于阴性对照组（56．84％±2．72％，P＜0．05）和空白对照组（57．19％±3．72％，P＜0．05）；而S期和G2／M期的细胞数，siRNA－TGM1转染组（32．78％±5．48％、3．66％±0．30％）明显低于阴性对照组（57．32％±2．91％、9．39％±0．68％，均 P＜0．05）和空白对照组（55．71％±2．84％、9．77％±0．52％，均 P ＜0．05）。免疫细胞化学检测结果显示， TGM1基因沉默后 cyclinD1、cyclin B1、CDK4呈阴性表达；Western印迹法检测结果显示， TGM1沉默后cyclin D1、cyclin B1、CDK4的蛋白条带亮度明显降低。结论 TGM1基因沉默后能阻断HaCaT细胞的细胞周期，使细胞周期停留在S期，不能进入G2／M期，无法完成DNA的合成，未完成细胞的分裂；TGM1基因沉默可能通过抑制细胞周期相关蛋白cyclin D1、cyclin B1、CDK4的表达影响表皮细胞的细胞周期。
-
TGM1基因过表达可抑制乳腺癌细胞的上皮-间质转化
目的:探究转谷氨酰胺酶1(transglutaminase 1,TGM1)基因过表达对乳腺癌细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响.方法:采用实时荧光定量PCR法检测鼠源性乳腺癌FE1.2和FE1.3细胞中TGM1mRNA的表达水平.采用脂质体法将携带有TGM1基因全长序列的重组载体质粒pCMV3-TGM1-GFPspark转染至FE1.2细胞中,构建TGM1基因过表达的FE12细胞株(FE12-TGM1).光学显微镜下观察FE12细胞形态的变化,FCM法测量细胞粒径的大小;MTT法检测TGM1基因过表达对鼠乳腺癌细胞增殖能力的影响;实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法分别检测EMT相关分子标志物上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、β-链蛋白(β-catenin)以及细胞周期调节蛋白D1 (cyclin D1)mRNA和蛋白的表达水平.后,采用细胞划痕愈合实验检测TGM1过表达对细胞迁移能力的影响.结果:FE1.3细胞中TGM1 mRNA的表达水平明显高于FE1.2细胞(P＜ 0.001).将重组载体pCMV3-TGM1-GFPspark转入FE1.2细胞后,FE1.2细胞中TGM1 mRNA和蛋白的表达水平明显上调(P＜0.001和P＜0.01),细胞形态发生明显改变,细胞的粒径增大(P＜0.01),而FE1.2细胞的增殖能力明显降低(P＜0.001).TGM1基因过表达的E1.2细胞中E-cadherin mRNA的表达水平明显上调(P＜0.01),vimentin mRNA及蛋白的表达水平均明显下调(P值均＜ 0.001),cyclin D1 mRNA的表达水平明显上调(P＜0.05),而cyclin D1蛋白表达水平无明显变化(P＞0.05),β-catenin mRNA的表达水平无明显变化(P＞0.05),β-catenin蛋白的表达水平明显下调(P＜ 0.01);TGM1过表达后FE1.2细胞的迁移能力明显减弱(P＜0.05).结论:TGM1基因过表达能抑制乳腺癌细胞的EMT.
-
FY-10诱导培养HaCat细胞分化的实验研究
目的:观察FY-10对无血清培养HaCat细胞分化的影响.方法:选择不同浓度的FY-10(10-5～10-9mol/L)分别添加于无血清培养的HaCat细胞培养液中,并在添加后24h回收总RNA,用逆转录PCR(RT-PCR)方法检测HaCat细胞分化的特异性标记TGase1、KBT6的mRNA表达情况.结果:FY-10添加后24h能显著的上调TGase1的mRNA的表达,其上调的程度与药物浓度成良好的线性关系;而FY-10对KRT6的mRNA表达呈显著的抑制作用,呈一定的剂量依赖性.结论:一定浓度下FY-10能上调无血清培养HaCat细胞对分化特异性标记蛋白TGase1 mRNA的表达,而对KRT6 mRNA有下调其表达的作用,促进HaCat细胞的分化,而抑制其增殖.
-
神经酰胺诱导培养角质形成细胞分化的实验研究
目的:观察神经酰胺对无血清培养角质形成细胞分化的影响.方法:选择两种神经酰胺(C2和C6),分别添加于无血清培养的角质形成细胞培养液中,并在添加后0、3、6、12、24h分别回收总RNA,用逆转录PCR(RT-PCR)方法,检测角质形成细胞分化的特异性标记:TGase1、IVL、KRT1、KRT10等mRNA表达情况.结果:神经酰胺添加后,C2-神经酰胺对TGase1 mRNA、IVL mRNA表达在12小时均明显上升,在24小时分别升高达阴性对照的5.7倍和5.2倍;但C2-神经酰胺对KRT1 mRNA和KRT10mRNA表达升高不明显.C6-神经酰胺对TGase1 mRNA、1VL mRNA表达大致与C2-神经酰胺相似,只是24小时表达比C2-神经酰胺降低,分别为阴性对照的3.3倍和3.5倍;但C6-神经酰胺对KRT1 mRNA和KRT10 mRNA表达显著高于C2-神经酰胺,24小时分别高达5.4倍和10倍.结论:神经酰胺能明显升高无血清培养的角质形成细胞对分化特异性标记蛋白mRNA的表达,诱导角质形成细胞的分化.
-
板层鱼鳞病患者指甲内皮蛋白与TGase1酶的表达及其TGM 1基因序列分析
目的 观察板层鱼鳞病(LI)患者指甲转谷氨酰胺酶 1(Tgase 1)与内皮蛋白的表达变化,分析其TGM 1基因序列.方法 分别自8例LI患者(LI组)和8例健康人(C组)的指甲中提取总蛋白进行SDS-PAGE电泳,分别采用免疫印迹及斑点印迹法检测内皮蛋白和Tgase 1.对LI组不同家系两个家族的2例患者血液进行TGM 1 基因序列分析.结果 LI组指甲总蛋白SDS-PSGE 电泳呈5条主带,即38、48、54、63、69 kDa,而C 组仅呈现前4条主带.LI组内皮蛋白主要定位于63、69 kDa主带,C组内皮蛋白仅定位于63 kDa主带.两组内皮蛋白及TGase1的灰度值(GSM)相比,P均＜0.05.2例 LI 患者TGM 1基因序列第8、12、13 外显子皆有错义的点突变.结论 LI患者的指甲内皮蛋白过度表达、 Tgase 1低表达,TGM 1 基因序列异常.
-
板层状鱼鳞病患者指甲和鳞屑内皮蛋白及鳞屑类脂的变化
目的:探讨板层状鱼鳞病(RLI)患者的指甲和鳞屑内皮蛋白和鳞屑类脂的表型改变情况.方法:取5例RLI患者和10 例正常人修剪的指甲和表皮鳞屑,行指甲内皮蛋白的免疫印迹、指甲和鳞屑内皮蛋白的免疫组化染色和鳞屑类脂的组织化学染色,利用在图像分析仪对所染色图像进行分析.结果:指甲总蛋白电泳图显示正常人呈现4条主带,RLI呈现5条主带(69 000、63 000、54 000、48 000、38 000);免疫印迹显示指甲内皮蛋白表达的相对分子质量主要位于63 000～158 000范围,其中RLI患者指甲内皮蛋白69 000呈过高表达.免疫组化显示RLI患者指甲和鳞屑内皮蛋白表达下调,组织化学染色显示鳞屑类脂中鳞脂、胆固醇和不饱和脂肪酸含量均降低.结论:RLI患者指甲和鳞屑内皮蛋白和鳞屑类脂分化不良.
-
Notch信号通路对体外培养小鼠角膜缘上皮细胞黏液素5AC表达的影响
目的 通过体外细胞分化模型探讨Notch信号通路对角膜缘上皮细胞分化过程中黏液素5AC(MUC5AC)表达的影响及其临床意义.方法 Western blot检测体外细胞培养24和48 h时Notch1、Notch2及Notch3蛋白在小鼠角膜缘上皮细胞中的表达情况;以小鼠体外正常培养角膜缘上皮细胞作为对照组,靶向转染Notch3 siRNA的细胞作为实验组,培养24、48和72 h后运用Western blot和Real-time PCR检测MUC5AC蛋白及mRNA的表达水平;RT-PCR检测转谷氨酰胺酶1 mRNA表达强度变化.结果 Western blot结果显示Notch3蛋白在角膜缘上皮细胞的表达高,其次是Notch2,Notch1表达不明显.与对照组相比,实验组MUC5AC的蛋白合成及mRNA表达显著下降,其蛋白合成于24、48和72 h分别下降了(64.3±35.0)％、(39.5±11.0)％和(41.3±8.3)％;mRNA分别下降了(42.9±14.2)％、(45.0±18.0)％和(46.4±21.0)％;转谷氨酰胺酶1的基因表达明显增强,24、48和72 h分别增加了(75.2±11.3)％、(89.7±15.5)％和(101.0±25.0)％.结论 Notch信号通路可影响MUC5AC基因及蛋白合成,对Notch信号的调节可能是治疗黏液素分泌不足型眼表疾病的一个新途径.
-
芳维A酸氨丁三醇对HaCaT细胞分化的影响
目的 观察芳维A酸氨丁三醇作用于无血清培养的HaCaT细胞后,细胞内分化相关基因TGase1表达的变化,探讨其剂量-时间曲线,并比较芳维A酸氨丁三醇与依曲替酸对HaCaT分化的影响. 方法将不同浓度的芳维A酸氨丁三醇和依曲替酸 (0.001～1.0μm/L )分别加入无血清培养的HaCaT细胞培养液中,在添加芳维A酸氨丁三醇6h、12h和24h后分别回收总RNA ,逆转录PCR(RT-PCR)法检测HaCaT细胞分化的特异性标记基因TGase1 mRNA的表达情况;芳维A酸氨丁三醇和依曲替酸分别在孵育24h后回收总RNA, 用RT-PCR法检测TGase1 mRNA的表达,比较这两种药物对HaCaT细胞分化的差异.结果 0.001～1.0μm/L浓度的芳维A酸氨丁三醇作用于HaCaT细胞6h、12h和24h后能显著促进HaCaT细胞内分化基因TGase1 mRNA表达,且呈剂量和时间依赖性(P<0.05).芳维A酸氨丁三醇及依曲替酸都可促进TGase1 mRNA表达,且TGase1 mRNA的表达呈剂量依赖性,这两种药物的剂量曲线非常相似,其促进TGase1 mRNA表达程度比较,差异无显著性意义( P>0.05).结论 芳维A酸氨丁三醇能显著促进HaCaT细胞内分化基因TGase1 mRNA的表达,且呈时间和剂量依赖性,其促进HaCaT细胞分化的作用与依曲替酸的效果类同.
-
TGM1基因表达沉默对角质形成细胞分化及角质化包膜形成相关蛋白表达的影响
目的 观察转谷氨酰胺酶l基因(transglutaminase 1,TGM1)表达沉默前、后对角质形成细胞的分化及角质化包膜形成相关蛋白表达的影响.方法 应用免疫细胞化学SP法和Western印迹法检测RNA干扰(RNAi)技术沉默TGM1基因表达前、后角质形成细胞分化标志物K10、内披蛋白、丝聚蛋白及角质化包膜形成相关的兜甲蛋白和富含脯氨酸的小蛋白(small proline-rich proteins,SPRRs)的表达差异.结果 免疫细胞化学检测显示:TGM1沉默后细胞K10、兜甲蛋白和富含脯氨酸的小蛋白呈弱阳性表达或阴性表达,而内披蛋白和丝聚蛋白呈中等阳性表达或强阳性表达;Western印迹法检测结果显示,TGM1沉默后K10、兜甲蛋白和富含脯氨酸的小蛋白的蛋白条带亮度明显降低,而内披蛋白和丝聚蛋白条带亮度与空白对照组和阴性对照组相比没有明显改变.结论 TGM1基因沉默可能通过抑制K10的表达影响表皮细胞分化;通过抑制角质化包膜形成相关蛋白兜甲蛋白和富含脯氨酸的小蛋白的表达影响表皮细胞角质化包膜的形成.
