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Ad－HGF基因修饰的胎盘间充质干细胞治疗兔肢体缺血的实验研究
目的：研究重组腺病毒介导肝细胞生长因子（ adenoviral vector mediated human hepatocyte growth factor，Ad－HGF）修饰的胎盘源间充质干细胞（ placenta－derived mesenchymal stem cells，PMSC）在兔肢体缺血模型中促新生血管生成的作用。方法无菌取足月产妇胎盘胎儿面中心区域胎盘组织，胶原酶消化法分离干细胞，体外培养传代，感染Ad－HGF 48 h后收集细胞用于治疗兔肢体缺血实验。左侧治疗组后肢缺血肌肉组织内多点注射总细胞数5×106／ml Ad－HGF修饰的PMSC，右侧对照组后肢缺血肌肉组织内注射生理盐水。结果治疗后第14天腹主动脉穿刺行数字减影血管造影（ digital subtraction angiography，DSA）检查，可见左侧肢体缺血治疗后微血管生成数明显多于未治疗右侧肢体，血管形成能力明显增强。苏木精伊红染色法（ HE）后置光镜下观察显示，治疗组毛细血管密度明显大于未治疗组（P＜0．05）。实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）检测后肢肌肉组织中血管内皮生长因子（ vascular endothelial growth factor， VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（ basic fibroblast growth factor，bFGF）、HGF的表达明显升高（P＜0．05）。结论经Ad－HGF基因修饰的PMSC能明显促进血管新生，加快局部缺血组织血流循环的重建，是治疗肢体慢性缺血的有效手段。
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大鼠注射重组腺病毒Ad-HGF后血清中抗腺病毒抗体的检测
目的 观察大鼠重复给与携带肝细胞生长因子基因的重组腺病毒(recombinant adenovirus carrying hepatocyte growth factor gene,Ad-HGF)后,血清中抗腺病毒抗体的出现时间及消失规律.方法 大鼠给与不同剂量的Ad-HGF共14次,利用病毒中和反应(细胞病变效应及绿色荧光方法 )观察血清中抗腺病毒抗体.结果 手术及正常对照组和实验组动物给药7次前血清处理的细胞均出现明显细胞病变效应及强荧光.之后各剂量组动物血清均对腺病毒有不同程度的中和作用,停药后13周到14周抗体水平很低或已不存在.同时观察到动物性别及给药剂量大小无差异.结论 大鼠肌注Ad-HGF 7次后,动物血清中可检测到抗腺病毒抗体,停药后13周或14周抗体基本消失,此结果 对Ad-HGF的实际应用具有指导意义.
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心肌显像联合冠状动脉造影及组织学检查在评价Ad-HGF治疗猪心肌梗死疗效中的价值
目的 探讨心肌静息显像联合冠状动脉造影及组织学检查在评价重组腺病毒-肝细胞生长因子(Ad-HGF)治疗猪实验性心肌梗死中的价值.方法 低、中、高剂量Ad-HGF治疗组[Ad-HGF剂量依次为108,4×108,5×109空斑形成单位(PFU)/点;均分10点注射],生理盐水对照组及空白对照组小型猪各5头,分别于治疗前后行静息心肌显像及冠状动脉造影,并于治疗后行组织学检查.结果 空白对照组及生理盐水对照组治疗前后心肌灌注及Rentrop评分无明显变化.各Ad-HGF治疗组治疗后心肌灌注及Rentrop评分较治疗前改善,低、中、高剂量组治疗前后冠状动脉左回旋支(LCX)供血节段得分分别为7.8±1.3和16.4±1.1(低),8.2±1.6和17.6±0.9(中),8.4±1.5和19.0±0.7(高);各组治疗前后LCX供血区域Rentrop评分分别为0.80±0.16和1.66±0.15(低),0.94±0.11和2.16±0.11(中),0.90±0.22和2.22±0.19(高).3组治疗前后数据比较差异均有统计学意义(P＜0.01).各Ad-HGF治疗组及空白对照组治疗后血管数量明显多于生理盐水对照组.结论 用心肌静息显像联合冠状动脉造影及组织学检查评价Ad-HGF治疗猪心肌梗死的疗效有价值.
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外源性HGF对增龄和动脉硬化大鼠HGF和TGF-β1平衡的影响
目的 研究携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒(Ad-HGF)注入增龄及老龄脑动脉粥样硬化模型大鼠蛛网膜下腔后,HGF-TGF-β1平衡与增龄和动脉粥样硬化的关系.方法 正常SD大鼠160只,随机分为增龄组(1月组、6月组、12月组、1月Ad-HGF组、6月Ad-HGF组、12月Ad-HGF组)、造模组(模型组、模型Ad-HGF组),每亚组20只,分别于第10、20、30天抽取脑脊液,用ELISA试剂盒测定HGF和TGF-β1的浓度,应用Western blot检测各组不同时间脑组织HGF和TGF-β1的浓度.结果 未注射Ad-HGF的组别脑脊液中未检测到HGF,注射Ad-HGF的组别不同时间均可检测到人HGF.随着年龄增长脑脊液及脑组织中HGF含量逐渐降低,TGF-β1含量逐渐增加.造模组脑脊液及脑组织HGF含量较增龄组逐渐增加,TGF-β1含量逐渐降低(P<0.05).结论 HGF与动脉硬化程度呈正相关,与年龄呈负相关;TGF-β1与动脉硬化程度呈负相关,与年龄呈正相关.HGF、TGF-β1水平随脑动脉硬化程度及年龄变化呈动态互逆平衡.
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重组腺病毒介导肝细胞生长因子基因对铅致动脉内皮细胞损伤的保护作用
目的 观察重组腺病毒介导肝细胞生长因子基因(Ad-HGF)对铅致动脉内皮细胞损伤的保护作用,为Ad-HGF保护血脑屏障提供理论依据.方法 实验设正常组、转染组、铅染组、转染加铅染毒组.转染加铅染毒组用Ad-HGF转染动脉内皮细胞48 h后,加入20μmol/L的醋酸铅,24h、48 h后分别用Giemsa染色法观察细胞形态学变化;细胞免疫化学法检测P53的表达;流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果 染色显示出铅单独染毒组细胞成凋亡形态学改变.转染加铅染毒组动脉内皮细胞的免疫化学结果显示P53阳性表达较对照组下降.MTT结果表明铅处理不同时间点(6 h、12 h、18 h、24 h、48 h)后,转染加铅染毒组细胞增殖率与铅单独染毒组比较没有显著升高(P＞0.05),转染组的增殖率略高于对照组(P＜0.05).醋酸铅组细胞凋亡率较对照组明显升高,转染组较未转染组比较细胞凋亡率明显下降.结论 Ad-HGF具有抗细胞凋亡作用,为解释Ad-HGF对铅致血脑屏障的损伤保护效应提供有力的理论和实验依据.
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Ad-HGF对肺泡Ⅱ型上皮细胞的转染表达及增殖效应
目的:观察Ad-HGF对肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ细胞)的转染表达及增殖效应.方法:以不同转染强度(50,100,200 MOI)Ad-GFP转染原代培养大鼠ATⅡ细胞,感染后48 h用流式细胞仪检测转染效率.并以佳感染强度Ad-HGF转染ATⅡ细胞,ELISA方法检测转染后48, 72 h上清中HGF的表达水平.用MTT法检测表达产物对肺泡上皮细胞的效应.结果:感染强度为100 MOI时,对ATⅡ细胞的转染效率已达89.61%,以100 MOI的Ad-HGF转染6×105细胞后48, 72 h上清中HGF的表达分别为(249.4±1.8) ng和(168.0±26.1)ng,且表达产物对ATⅡ细胞有明显的促增殖作用.结论:Ad-HGF可有效转染ATⅡ细胞并在细胞中表达,表达产物对该细胞有明显的促增殖作用.
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比格犬注射重组腺病毒Ad-HGF后血清中抗腺病毒抗体及中和抗体的检测
目的:观察Beagle犬重复给予Ad-HGF后血清中抗腺病毒抗体及抗肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)抗体的出现时间及消失规律. 方法:将24只比格犬随机分为四组:正常对照组、手术对照组、Ad-HGF小剂量组(2.4×107 pfu/ kg)和Ad-HGF大剂量组(2.4×108 pfu/ kg). Ad-HGF各组犬给予不同剂量Ad-HGF共14次. 在给药2次后分别利用病毒中和反应和ELISA 方法检测血清中抗腺病毒抗体和抗HGF抗体. 结果:手术组、正常对照组及实验组动物于给药前及给药3次时血清细胞均未出现明显中和反应. 给药4次后各剂量组动物血清均对腺病毒有不同程度中和作用,至停药后12 wk抗体水平很低或已不存在. 各时间点血清样品中未检测到抗HGF抗体. 结论:犬肌注Ad-HGF 4次后动物血清中检测到了抗腺病毒抗体,停药4 wk后抗体水平有不同程度下降,直至12 wk后血清中腺病毒抗体基本消失.
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Ad-HGF修饰MSCs异体移植对烧伤创面愈合的作用
目的:探讨携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒(Ad-HGF)修饰的骨髓间充质干细胞(MSCs)局部异体移植对烧伤创面愈合的作用.方法:密度梯度离心法体外分离培养雄性Wistar大鼠MSCs,并以感染复数(MOI=100)体外转染Ad-HGF.30只雌性Wistar大鼠随机分为:MSCs治疗组(A组),Ad-HGF修饰MSCs治疗组(B组),Ad-GFP修饰MSCs治疗组(C组),Ad-HGF治疗组(D组),空白对照组(E组).复制大鼠深Ⅱ度烧伤模型,将细胞悬液、病毒悬液及生理盐水于创面下多点注射.伤后3、5、7、14、21 d观察创面收缩率并采集创面标本,行HE染色观察创面愈合情况.结果: 伤后7、14 d B组与A组、C组、D组、E组比较,创口收缩率显著提高(P＜0.05); HE染色可见B组表皮明显厚于其他各组,并可见钉脚下伸.结论:Ad-HGF修饰MSCs异体移植可显著提高烧伤创面愈合速度和质量,为烧伤创面修复提供了新的策略.
