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兔晶状体蛋白质组的双向电泳和质谱鉴定研究
目的探讨双向电泳和质谱鉴定在晶状体蛋白质组特性研究中的价值,为白内障的防治提供新的有效途径.方法采用固相pH梯度(IPG)等电聚焦双向凝胶电泳方法对兔龄为3个月的新西兰兔透明晶状体蛋白质进行分离,使用ImageMaster 2D Elite 3.01图像分析软件分析电泳图像,使用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱仪对主要的高丰度晶状体蛋白质进行鉴定. 结果双向电泳图谱显示,在250 μg兔晶状体中蛋白质分布在等电点(PI)为pH值 5～9、相对分子质量为14 000～94 000的区域内;而高丰度晶状体蛋白质的相对分子质量为14 000～40 000.图像分析软件定量检出180个蛋白质斑点的近似PI、相对分子质量及蛋白质相对含量,质谱鉴定得到其中16个高丰度晶状体蛋白质的种类.结论双向电泳和质谱鉴定可有效分离和分析晶状体蛋白质组的特性,为分析白内障形成过程中蛋白质的表达改变提供了新的方法和途径,为白内障的防治带来了新的前景.
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特殊表型遗传性先天性白内障的超微结构和基因定位
目的探讨一表型特殊、晶状体呈簇状混浊的常染色体显性遗传性先天性白内障(ADCC)的超微结构,并初步定位该疾病的相关候选基因.方法收集特殊表型ADCC一家系资料,对家系成员行眼部检查;在光学显微镜和透射电镜下观察晶状体细胞超微结构的改变;选择γ-晶状体蛋白基因附近多个微卫星位点,对该家系ADCC疾病相关候选基因进行连锁分析.结果光学显微镜下特殊表型ADCC患者晶状体纤维细胞失去正常排列规则,产生不规则折光,并可见网格样改变、黏液样变性及结晶样物质析出等局灶性退行性变;透射电镜下可见细胞皱缩、变形,失去正常长六边形形态,细胞间隙增宽,细胞内可见异常高密度球形颗粒沉着.连锁分析结果显示,该家系ADCC疾病相关候选基因与微卫星位点D2S2208、D2S2382及D2S164连锁,大LOD值为3.34.结论特殊表型ADCC的特异性病理学改变集中在晶状体纤维细胞,其疾病相关候选基因极可能为γ-晶状体蛋白基因.(中华眼科杂志,2004,40:306-310)
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年龄和离体翻译后修饰对兔α-晶状体蛋白分子伴娘活性的影响
目的探讨年龄和离体翻译后修饰对兔α-晶状体蛋白分子伴娘活性的影响.方法(1)用凝胶过滤法分离幼年、成年和老年3个组兔水溶性晶状体蛋白,观察不同年龄兔α-晶状体蛋白抑制β-low晶状体蛋白凝集和变性作用的程度差异.(2)孵育α-晶状体蛋白使之氧化和糖基化,观察修饰和未修饰的α-晶状体蛋白抑制β-low晶状体蛋白凝集和变性作用的程度差异.结果 (1)3个年龄组α-晶状体蛋白抑制热诱导β-low晶状体蛋白凝集和变性作用的程度差异有显著意义(F=29.100,P<0.01),成年组兔α-晶状体蛋白的抑制作用强于老年组,弱于幼年组,差异有显著意义(q=4.192 4,4.333 9;P<0.05).(2)离体氧化和糖基化修饰的α-晶状体蛋白抑制β-low晶状体蛋白凝集和变性的作用均弱于未修饰的α-晶状体蛋白,差异有显著意义(q=26.917 1,11.640 4;P<0.01).结论 (1)随着年龄的增加,兔α-晶状体蛋白的分子伴娘活性呈下降趋势.(2)离体翻译后修饰可使兔α-晶状体蛋白的分子伴娘活性下降.
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大鼠视网膜神经节细胞存活和突起生长与可溶性混合晶状体蛋白的促进作用体外培养实验
目的:观察不同培养基中血清和混合晶状体蛋白对视网膜神经节细胞的影响,探讨晶状体损伤后其促进视网膜神经节细胞存活和再生的作用.方法:实验于2004-04/07在解放军第三军医大学西南眼科医院眼科实验室完成.选择成年Long Evens大鼠8只用于可溶性混合晶状体蛋白的提取;选择新生0～2 d Long Evens大鼠30只用于视网膜神经节细胞的培养.分别用下列3组培养基对离体视网膜神经节细胞进行培养:①100 mL/L新生牛血清+900 mL/L DMEM/F12培养基(新生牛血清+DMEM/F12组).②100 mL/L新生牛血清+100 mL/L胎牛血清+800 mL/L DMEM/F12培养基(新生牛血清+胎牛血清+DMEM/F12组).③100 mL/L胎牛血清+900 mL/L DMEM/F12培养基(胎牛血清+DMEM/F12组).每组又分为6个亚组,其中5个亚组分别加入5种不同终浓度的可溶性混合晶状体蛋白(1,0.5,0.02,0.01,0.005 mg/L)溶液,一个亚组不加可溶性混合晶状体蛋白液.每天在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况,记录存活细胞数和存活时间.培养2,4,6 d后,计数每视野分散的、有突起生长的视网膜神经节细胞数和长突起长度(每一视野随机取5个细胞进行测量,共30个视野,150个突起)应用Leica QWin图像分析系统.结果:①视网膜神经节细胞存活时间:新生牛血清+DMEM/F12组培养细胞能存活六七天,新生牛血清+胎牛血清+DMEM/F12组和胎牛血清+DMEM/F12组培养细胞能存活七八天.②有突起生长的视网膜神经节细胞数目和长突起长度:在相同培养天数(2,4,6d)和条件下(加入同一终浓度晶状体蛋白)新生牛血清+胎牛血清+DMEM/F12组细胞数目均多于新生牛血清+DMEM/F12组[加入0.5 mg/L晶状体蛋白,2 d时(3.83±4.53比0.14±0.38)个/视野,(4 d时14.7±9.62比2.5±3.89)个/视野,P＜0.01;6 d时(20.13±12.32比5.43±5.62)个/视野,P＜0.05];在4 d内胎牛血清+DMEM/F12组细胞突起长度明显优于新生牛血清+胎牛血清+DMEM/F12组(P＜0.01);加入混合晶状体蛋白后细胞存活时间及突起长度明显长于未加晶状体蛋白组,晶状体蛋白液含量为0.01 mg/L时,作用较明显.结论:加入晶状体蛋白液和不同血清的培养基两因素间无交互作用,分别独立地发挥作用.可溶性混合晶状体蛋白可以促进体外培养的视网膜神经节细胞存活和突起生长.
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半乳糖诱导白内障大鼠异常晶状体蛋白X36与白内障形成的关系
目的:研究半乳糖诱导白内障大鼠异常晶状体蛋白X36的出现及其与白内障形成的关系.方法:半乳糖饲养SD大鼠,诱导白内障;选不同年龄大鼠(出生后1天、2周、8周、8个月及1.5年)作老化进程对照组;提取水溶性晶状体蛋白,双向电泳(等电聚焦/SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,IEF/SDS-PAGE)得到大鼠晶状体蛋白电泳图形,考马斯亮蓝染色后扫描蛋白图形并确认各主要晶状体蛋白组分及异常晶状体蛋白X36.结果:(1)异常晶状体蛋白X36相对分子质量约27 000、等电点约4.5.(2)X36蛋白在对照组不同年龄大鼠的水溶性晶状体蛋白中均未出现.(3)X36蛋白在Ⅲ期及以后各期糖性白内障大鼠的眼晶状体水溶性蛋白中均有出现,且含量逐期增加.结论:半乳糖诱导大鼠白内障形成过程中出现异常晶状体蛋白X36,该蛋白含量随白内障程度加重而增加,与大鼠生理性老化无关.
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α晶体蛋白对LPS刺激及视神经损伤后大鼠视网膜小胶质细胞增殖及数量的影响
目的 研究α晶体蛋白对大鼠视网膜小胶质细胞增殖能力及视神经损伤后小胶质细胞数量的影响.方法 脂多糖激活离体培养视网膜小胶质细胞,模拟视神经损伤,采用MTF分析α晶体蛋白对激活的小胶质细胞增殖能力的影响;建立大鼠视神经不全损伤模型,损伤后玻璃体腔注射α晶体蛋白,采用视网膜铺片及免疫荧光标记小胶质细胞并计数,比较不同组小胶质细胞的数量.结果 10-g/L～10-2 g/L浓度的脂多糖均可激活小胶质细胞(P＜0.05),10-6g/L和10-4g/L浓度的α晶体蛋白可明显抑制10-6g/L浓度的脂多糖激活的小胶质细胞的增殖;视神经损伤1～3周,α晶体蛋白注射组小胶质细胞的数量明显少于损伤组(P＜0.05).结论 α晶体蛋白可抑制视网膜上小胶质细胞的增殖和活化,减轻小胶质细胞对RGCs的过度吞噬和继发性损害,可能是视神经损伤后α晶体蛋白问接保护RGCs存活的另一机制.
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玻璃体注射α-晶体蛋白对视神经损伤后视网膜神经节细胞的保护作用
目的 在体观察α-晶体蛋白对LongEvens大鼠视神经损伤后视网膜神经节细胞(RGCs)存活的保护作用. 方法 于视神经损伤前7 d经上丘及外侧膝状体逆行标记RGCs.成年LongEvens大鼠35只,其中10只用于提取α-晶体蛋白,另外25只分成5组,分别为正常对照组和伤后1,2,3,4周组,每组5只.右眼经玻璃体腔注射浓度为1×10-5g/L的α-晶体蛋白5 μl,左眼注射牛血清白蛋白5 μl,分别于伤后1,2,3,4周对实验大鼠行RGCs计数. 结果 视神经夹伤后1周RGCs数明显下降,牛血清白蛋白组下降为正常值的33%;视神经夹伤后2周下降为正常值的4%,3周时下降为正常值的3%, 4周时下降为正常值的1%.玻璃体腔注射α-晶体蛋白组在视神经夹伤后1周RGCs数下降为正常值的51%;2周时RGCs数下降为正常值的11%;3周时RGCs数下降为正常值的7%,4周时下降为正常值的3%,均显著高于对照组(P＜0.01). 结论 视神经损伤后玻璃体腔注射可溶性α-晶体蛋白能够延缓RGCs死亡,具有一定的保护作用.
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晶体蛋白对离体培养的大鼠视网膜神经节细胞的作用
目的研究晶体蛋白能否促进离体培养的视网膜神经节细胞(RGCs)存活和生长,初步探讨损伤晶状体促进RGCs的存活和轴突再生的确切作用物质. 方法分别用晶体蛋白、晶体蛋白激活的巨噬细胞培养液及DMEM对RGCs进行培养,观察RGCs在体外存活时间,测量培养1,3,5 d有突起RGCs数、长突起长度及细胞活性,进行组间比较. 结果 (1)晶体蛋白组细胞能存活12～14 d,较其他两组显著延长(P＜0.05).(2)培养1,3,5 d,各实验组有突起的RGCs数均明显多于对照组(P＜0.01),晶体蛋白组有突起的RGCs数较其激活的巨噬细胞培养液组明显增多(P＜0.01).(3)培养1,3,5 d,各实验组RGCs长突起长度均较对照组显著延长(P＜0.01),且晶体蛋白组与其激活的巨噬细胞培养液组比较,差异有统计学意义(P＜0.01).(4)培养3 d和5 d时,晶体蛋白组细胞活性显著高于对照组 (P<0.01). 结论 (1)晶体蛋白对离体培养的RGCs存活和生长具有显著的直接促进作用;(2)晶体蛋白也可通过激活巨噬细胞间接发挥作用,但以直接作用为主.
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α晶体蛋白与视网膜神经节细胞结合的细胞定位研究
目的 对α-晶体蛋白与视网膜神经节细胞(RGCs)之间的作用进行定位研究.方法 原代培养RGCs,Thy1.1免疫荧光法鉴定RGCs并进行纯度检测,将α-晶体蛋白与RGCs共孵育,应用免疫细胞化学方法, 对α-晶体蛋白在RGCs上的靶分子进行间接免疫标记,再以光镜、激光共聚焦显微镜和电镜观察标记物,对α-晶体蛋白与RGCs的结合进行亚细胞定位.结果 Thy1.1鉴定RGCs纯度为90%～95%.RGCs免疫组化染色结果显示,α-晶体蛋白与其靶分子结合复合物在RGCs膜上呈阳性表达;共聚焦显微镜下发现RGCs有免疫荧光复合物沉积,大量呈"戒指"状分布于细胞膜,少量分布于细胞轴突上.电镜结果显示,RGCs上有免疫复合物沉积,呈"线状"分布在细胞膜上,对照组呈阴性.结论 α-晶体蛋白能与RGCs发生结合,其作用靶点在RGCs膜上.α-晶体蛋白与RGCs的结合不是吸附作用,但是否为受体-配体性质的结合还需进一步验证.
