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核心蛋白聚糖抑制转化生长因子β1诱导的人肾小管上皮细胞转分化机制研究
目的 研究核心蛋白聚糖抑制转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人肾小管上皮细胞-间充质细胞-转分化(EMT)的机制.方法 将体外培养的人肾小管上皮细胞(HK-2)分为4组:(1)阴性对照组;(2)100 ng/ml核心蛋白聚糖组;(3)10 ng/ml TGF-β1组;(4)100 ng/ml核心蛋白聚糖和10ng/ml TGF-β1组.Western blot法检测信号通路ERK、PI3K、Smad_3的磷酸化水平和β-catenin的蛋白水平;实时定量-PCR检测snail mRNA的表达情况,逆转录-PCR检测淋巴细胞增长因子1(LEF-1)mRNA的表达情况.结果 (1)与对照组相比,TGF-β1诱导组ERK(1.11 ±0.09:0.47 ±0.07)、PI3K(14.79 ±1.02:2.48 ±0.06)、Smad_3(0.95 ±0.02:0.08 ±0.01)的磷酸化水平明显增高,snail(2.59±0.70:1.02±0.13)、LEF-1(1.85 ±0.08:0.30 ±0.11)的mRNA的表达量明显增高,β-catenin(1.46 ±0.20:0.49±0.05)的明显增高;(2)单纯核心蛋白聚糖组与对照组相比,所得结果 差异均无统计学意义.核心蛋白聚糖和TGF-β1共同刺激组与TGF-β1组相比,ERK(0.58 ±0.08)的磷酸化水平及snail mRNA(1.24 ±0.03)的表达量明显降低而PI3K(15.84 ±1.64),Smad_3(0.90 ±0.04)的磷酸化水平,LEF-1的mRNA(1.64 ±0.07)、β-catenin(1.42±0.09)的量差异无统计学意义.结论 核心蛋白聚糖抑制TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞EMT可能是通过阻止ERK信号转导通路实现的.
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分化抑制因子Id3在散发性大肠腺癌中的表达及其与淋巴结转移的关系
目的 观察分化抑制因子Id3在正常大肠黏膜、大肠腺瘤、散发性大肠腺癌组织中的表达,探讨其与各临床病理特征的关系.方法 采用免疫组织化学二步法(EnVision System)检测经病理证实的18例患者的正常大肠黏膜组织,30例患者的大肠腺瘤组织,35例患者的散发性大肠腺癌组织中Id3的表达情况.结果 Id3的阳性表达率在正常大肠黏膜、大肠腺瘤及散发性大肠腺癌组织中分别是11.1%,70.0%和88.5%,差异有统计学意义(P＜0.05).大肠腺癌中Id3的表达与淋巴结转移有关,与患者的性别,年龄,肿瘤浸润程度、大小、分化程度无相关性(P＞0.05).结论 Id3在大肠腺瘤、散发性大肠腺癌中均有表达,其可能参与大肠腺瘤的发生、发展及癌变,可促进散发性大肠腺癌淋巴结转移,同时Id3高表达可作为判断散发性大肠腺癌转移的一个潜在的重要指标,对其治疗及预后有重要的临床意义.
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靶向抑制Id1基因调控Wnt信号通路促进骨肉瘤MG63细胞凋亡
目的:研究分化抑制因子1(inhibitor of differentiation 1,Id1)基因对人骨肉瘤细胞MG63凋亡的影响,并探讨可能的作用机制.方法:通过重组腺病毒感染的方法将特异性针对M1基因的Id1-siRNA转入骨肉瘤细胞MG63中,分别采用半定量RT-PCR和蛋白质印迹法检测Id1 mRNA和蛋白的表达水平;Annexin V-FITC单染法及DAPI染色法检测对细胞凋亡的影响,FCM法检测对细胞周期分布的影响.蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白Bcl-2和survivin,以及Wnt信号通路关键蛋白β-链蛋白(β-catenin)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体2(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor2,ROR2)和CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein,CHOP)蛋白的表达水平.结果:采用重组腺病毒Ad-Id1-siRNA感染MG63细胞后,Id1 mRNA及蛋白的表达水平均明显下调(P值均＜ 0.05);Annexin V-FITC单染法和DAPI染色检测结果显示,沉默Id1基因表达后MG63细胞的凋亡率明显提高(P值均＜ 0.05);半定量RT-PCR和蛋白质印迹法检测结果显示,抗凋亡因子Bcl-2和survivin mRNA及蛋白的表达水平均明显下调(P值均＜0.05);蛋白质印迹法检测结果显示,Wnt信号通路关键蛋白β-catenin以及Wnt通路相关蛋白ROR2和CHOP的表达水平均明显下调(P值均＜0.05).结论:靶向沉默Id1基因表达能促进骨肉瘤细胞的凋亡,其作用可能与抑制Wnt信号通路的活性有关.
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BMP9通过BMPs/SMAD信号通路抑制肺腺癌A549细胞的增殖
目的:探讨骨形态发生蛋白9 (bone morphogenetic protein 9,BMP9)是否可以通过BMPs/SMAD信号通路抑制人肺腺癌细胞A549的增殖.方法:采用慢病毒感染的方式将外源性BMP9转入人肺腺癌A549细胞中,并应用半定量RT-PCR及蛋白质印迹法检测病毒感染后A549细胞中BMP9表达的改变.采用MTT法和FCM法检测BMP9过表达对A549细胞增殖和周期的影响.蛋白质印迹法检测BMPs/SMAD信号通路中总SMAD1/5/8和磷酸化SMAD1/5/8蛋白表达水平的改变.半定量RT-PCR及蛋白质印迹法检测BMP9过表达对分化抑制因子3(inhibitor of differentiation 3,ID3)mRNA和蛋白表达的影响.将构建有BMP9的慢病毒和构建有SMAD4-shRNA的慢病毒共感染A549细胞,以阻断BMPs/SMAD通路的激活,采用蛋白质印迹法检测磷酸化SMAD1/5/8和ID3表达的改变.结果:与空白对照组和阴性对照组相比,感染BMP9慢病毒后A549细胞中BMP9 mRNA和蛋白表达水平明显升高(P值均＜0.05).MTT法和FCM法检测结果显示,病毒感染3d后,BMP9过表达组吸光度(D)值均较空白对照组的和阴性对照组明显降低(P值均＜0.05);细胞周期阻滞在G2/M期,G2/M期细胞所占的比例均较空白对照组和阴性对照组明显提高(P值均＜ 0.05).蛋白质印迹法检测结果提示,BMP9过表达可使磷酸化SMAD1/5/8和ID3蛋白的表达水平明显上调,激活BMPs/SMAD通路.当干扰BMPs/SMAD信号通路关键分子SMAD4的表达后,可抑制BMP9激活的BMPs/SMAD通路,下调磷酸化SMAD1/5/8和ID3蛋白的表达水平(P值均＜0.05).结论:BMP9可通过激活BMPs/SMAD信号通路,上调ID3的表达来抑制A549细胞的增殖.
关键词： 癌 非小细胞肺 骨形态发生蛋白质类 分化抑制蛋白质类 BMPs/SMAD信号通路 -
白血病ID4基因核心启动子区甲基化及其表达
目的:探讨DNA结合抑制因子4(inhibitor of DNA binding 4,ID4)基因核心启动子区甲基化及其蛋白表达与儿童急性白血病(acute leukemia, AL)的关系.方法:采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific polymerase chain reaction, MS-PCR)对32例初发白血病患儿、34例同期非肿瘤疾病儿童(对照组)及白血病细胞株Jurkat和Molt4进行ID4基因启动子区甲基化状况分析,并进行测序.RT-PCR检测ID4 mRNA的表达,免疫组织化学法检测ID4蛋白的表达.结果:ID4基因启动子区在Jurkat和Molt4细胞中均呈完全甲基化状态,而初发急性淋巴细胞及非淋巴细胞白血病患儿中完全甲基化率显著高于对照组患儿(81.0% vs 17.6%, P<0.001; 63.6% vs 17.6%, P<0.005).测序分析显示在完全甲基化状态的ID4基因核心启动子区所有CpG岛均呈甲基化状态.呈完全甲基化状态的白血病患儿和Jurkat、Molt4细胞中均无ID4 mRNA表达,而白血病组ID4蛋白表达显著低于对照组(P<0.001).结论:儿童白血病及某些白血病细胞株存在ID4基因核心启动子区高程度的甲基化.完全的甲基化状态可使ID4基因表达沉默,ID4蛋白表达缺失.
