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高血糖致胎鼠神经管畸形的发生机理及牛磺酸拮抗作用的研究
目的探讨高血糖、农药敌枯双的胎鼠致畸机理及牛磺酸的拮抗作用.方法采用皮下注射高渗葡萄糖的方法致孕鼠高血糖(高血糖组)、给孕鼠饮用敌枯双(敌枯双组)、给孕鼠饮用牛磺酸(牛磺酸拮抗组)及其各自对照组,RT-PCR及免疫组化方法检测各组胚胎组织中Pax3及Cx43基因的mRNA及其蛋白的表达.结果高血糖组孕鼠血糖为(13.4±0.8) mmol/L,吸收胎发生率为9.6%、死胎发生率为4.3%及神经管缺陷畸形发生率为8.6%,Pax3 mRNA表达降低(0.97±0.20),Pax3蛋白也降低(0.11±0.02),Cx43 mRNA过度表达(7.05±1.63),Cx43蛋白表达升高(0.94±0.05);敌枯双组孕鼠Pax3 mRNA的表达与高血糖组比较,无明显改变.但Cx43 有过度表达(Cx43 mRNA 6.96±0.73,Cx43蛋白0.92±0.12),与高血糖组比较,差异有极显著性(P<0.01);牛磺酸组孕鼠的死胎、神经管缺陷畸形发生率均为0%,吸收胎发生率为2.8%, Pax3及Cx43mRNA和蛋白均无过度表达现象.结论 (1)高血糖可能是糖尿病致畸的主要原因,其致畸机理可能是诱发Pax3基因突变,继而使Cx43基因过度表达;(2)敌枯双的致畸作用可能是通过诱导Cx43基因过度表达而造成的;(3)牛磺酸可通过改善Pax3及Cx43基因的表达而拮抗高血糖及敌枯双对胎鼠的致畸作用.
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K562细胞诱导分化过程中早期生长反应基因mRNA表达的研究
目的通过12-0-十四酰基咐哌醇-13-乙酸酯(TPA)诱导K562细胞分化,探讨白血病细胞早期生长反应基因(EGR-1)的表达及与细胞分化的关系.方法应用体外细胞培养技术通过细胞形态、细胞化学染色观察细胞分化的情况;用流式细胞术、逆转录-聚合酶链反应等技术检测细胞周期、细胞表面分化抗原CD33、CD14及EGR-1mRNA的表达.结果 TPA作用后K562细胞形态趋向成熟分化,非特异性酯酶(NSE)染色阳性,多可被氟化钠抑制;多数细胞被阻滞在G0+G1期,S期细胞减少;随处理时间的延长细胞表面抗原CD33表达有所减少,CD14表达逐渐增多;EGR1mRNA仅在TPA诱导K562细胞分化过程中表达.结论 TPA可诱导K562细胞向单核或巨噬细胞分化;EGR1-mRNA在TPA诱导K562细胞分化过程中才有表达,它可能参与K562细胞向单核或巨噬细胞分化的过程,并在诱导和维持细胞分化方面可能发挥重要作用.
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哮喘患儿转录因子T-bet/GATA-3 mRNA表达及其与杀伤性T淋巴细胞平衡间的关系
目的 研究转录因子T-bet/GATA-3在小儿哮喘发病以及杀伤性T淋巴细胞Tc1/Tc2失衡中的作用.方法 通过半定量RT-PCR检测38例哮喘患儿(哮喘发作组20例,缓解组18例)及20例正常对照组儿童外周血单个核细胞(PBMC)中T-bet、GATA-3mRNA表达情况,同时采用三色荧光流式细胞仪检测哮喘患儿的Tc1、Tc2细胞数量,并对T-bet、GATA-3mRNA表达水平与Tc1、Tc2细胞比率进行相关分析,了解T-bet/GATA-3对哮喘患儿的Tc细胞分化的调节作用.结果 (1)哮喘患儿外周血淋巴细胞转录因子T-bet mRNA表达水平低于正常对照组(0.28±0.03),其中哮喘发作组(0.14±0.04)显著低于哮喘缓解组(0.21±0.03)(P＜0.05);转录因子GATA-3 mRNA表达水平高于正常对照组(0.37±0.04),其中哮喘发作组(0.49±0.09)高于哮喘缓解组(0.44±0.08)(P＜0.05).(2)哮喘患儿外周血淋巴细胞亚群Tc1百分率低于正常对照组(31.2±3.8),其中哮喘发作组(6.6±2.4)又低于哮喘缓解组(14.2±4.3)(P＜0.05);Tc2细胞百分率高于正常对照组(3.5±1.1),其中哮喘发作组(10.0±4.2)又高于哮喘缓解组(5.4±2.2)(P＜0.05).(3)哮喘患儿T-betmRNA表达量与Tc1细胞比率呈正相关(r=0.704),与Tc2细胞比率呈负相关(r=-0.629);GATA-3mRNA表达量与Tc1细胞比率呈负相关(r=-0.612),与Tc2细胞比率呈正相关(r=0.673);T-bet/GATA-3 mRNA比值与Tc1细胞比率呈正相关(r=0.731),与Tc2细胞比率呈负相关(r=-0.642),与Tc1/Tc2比值呈正相关(r=0.773).结论 哮喘患儿T-bet/GATA-3 mRNA表达水平失调,与哮喘患儿的T细胞呈现Tc2优势分化密切相关.
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人细小病毒B19 VP1独特区基因变异的研究
目的获取人细小病毒B19(HPV B19) VP1 独特区基因,并进行序列测定及变异分析,为研制诊断试剂及预防疫苗创造条件.方法应用聚合酶链反应(PCR)技术从1例急性特发性血小板减少性紫癜患儿的血清中扩增HPV B19 VP1 独特区基因片段,将其克隆至pGEM-T easy载体,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,测定目的基因的序列.结果成功地扩增到HPV B19 VP1 独特区全长基因,长度为705个核苷酸,测定结果与Genbank中Gallinella G 和 Venturoli S所发表的HPV B19 VP1 独特区全长基因序列比较,有2处核苷酸发生突变,但所编码的氨基酸均未发生变化.结论 (1)HPV B19 VP1 独特区有基因变异;(2)构建了HPV B19 VP1 独特区基因的重组质粒,所获实验结果为深入研究奠定了基础.
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单链抗体A 7基因的原核细胞表达
[目的]制备抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A7基因,为基因治疗重症肌无力奠定基础.[方法]构建含有抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因的重组原核表达载体pHEN 2-单链抗体A 7,将其转化至大肠杆菌HB2151中,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)为诱导剂,在外周质中进行表达,以硼酸钠裂解细菌细胞壁,制备含有单链抗体的裂解液,应用鼠抗c-myc单克隆抗体的斑点杂交试验检测表达的单链抗体A 7基因.[结果]在大肠杆菌的外周质中可见单链抗体A7基因表达,培养上清液中未见单链抗体A 7基因表达.[结论]抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因在原核细胞成功表达.
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C/EBPα基因在大鼠肝星状细胞内的表达及意义
目的初步探讨CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)在肝星状细胞(HSC)激活过程中的作用. 方法采用免疫细胞化学、western blot及RT-PCR检测原代培养不同时间段HSC内C/EBPα蛋白和mRNA的表达,以及α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、结蛋白、基质金属蛋白酶-2(MMP2)mRNA、I型前胶原(α 1)mRNA的表达; Lipofect AMINE2000介导的瞬时转染方法将pcDNA3.1(-)-C/EBPα真核表达质粒转染入激活的HSC内,采用免疫细胞化学方法鉴定转染成功及转染后HSC内增殖细胞核抗原(PCNA)的表达;在相差显微镜下观察HSC在原代培养过程中形态的改变.结果原代正常HSC中可以检测到C/EBPα m RNA和蛋白的表达,蛋白位于细胞质和细胞核内,但主要位于细胞质内,且除新鲜分离(0 d)组以外,随着HSC培养至2、4、7、10 d,C/EBP α蛋白和mRNA的表达呈逐步下降的趋势,而α-SMA、MMP2和I型前胶原(α1)的表达则逐步增强;转染后24 h,目的基因转染组HSC内C/EBPα的表达明显强于空载体对照组,而PCNA的阳性细胞数较空载体对照组明显减少;转染后36 h,目的基因转染组细胞几乎全部死亡,残存的细胞形态变细,体积缩小,而空载体对照组细胞仍存活.结论 C/EBP α基因可能参与HSC的激活调控机制,且C/EBPα过表达对HSC的增殖存在抑制作用.
