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G9a特异性siRNA表达载体的构建及在QBC939细胞中对G9a基因表达的影响
目的 构建特异性组蛋白甲基转移酶Gga基因的siRNA表达载体并检测QBC939细胞对G9a表达的抑制作用.方法 设计、合成Gga特异性的短链寡核苷酸,经退火形成双链DNA片段,克隆到pSilencer neoTM 2.1-U6载体中,构建Gga特异性siRNA的表达载体,EcoR I+BamH I和EcoR I+Hind Ⅲ双酶切及测序鉴定重组体,并转染QBC939细胞,G418筛选出稳定表达细胞株,半定量RT.PCR方法和Western印迹法检测Gga mRNA和蛋白的表达水平.结果 双酶切与测序鉴定证实成功构建了G9a.siRNA表达载体,转染人胆管癌细胞株QBC939后,在mRNA和蛋白表达水平对G9a的抑制率分别为55.2%和54.8%.结论 运用pSilencer neoTa 2.1-126载体构建的G9a.siRNA表达载体可有效抑制Gga在胆管癌细胞株QBC939中的表达.
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BIX-01294对肝癌细胞增殖能力的影响
目的 哺乳动物细胞中H3K9的甲基化是引起基因表达抑制的主要修饰标记之一,H3K9的二甲基化在维持肿瘤细胞自我复制方面所起的作用仍不清楚.本研究将探讨组蛋白甲基化转移酶G9a抑制剂BIX-01294对肝癌细胞增殖的影响及其作用机制.方法 将肝癌细胞HepG2和Huh7分为BIX-01294处理组和空白对照组,用5μmol/L的BIX-01294分别处理24、48和72h.CCK-8法检测BIX-01294对肝癌细胞增殖的影响;流式细胞术检测对细胞周期的影响;蛋白质印迹法检测细胞周期相关蛋白CyclinB1、细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子p27、组蛋白H3及组蛋白H3K9二甲基化(H3K9me2)水平的变化.结果 随着作用时间的延长,5μmol/L的BIX-01294对肝癌细胞有抑制增殖作用,且具有时间依赖性;在处理肝癌细胞24、48和72 h后,HepG2细胞的存活率分别为95.27％、92.19％和53.94％,F=76.058,P＜0.001;Huh7细胞的存活率分别为93.11％、86.12％和47.72％,F=99.832,P＜0.001.流式细胞术检测结果表明,BIX-01294处理组肝癌细胞发生G0/G1阻滞,且阻滞呈时间依赖性.分别处理24、48和72 h时,HepG2细胞G0/G1细胞比例分别为(70.55±1.38)％、(72.27±0.59)％和(79.63±3.40)％,F=19.937,P＜0.001;Huh7细胞G0/G1细胞比例分别为(72.34±0.60)％、(80.36±0.78)％和(79.77±1.01)％,F=256.060,P＜0.001.蛋白质印迹法检测结果显示,与对照组相比,组蛋白H3表达无显著改变,G9a、组蛋白H3K9二甲基化(H3K9me2)水平及细胞周期相关蛋白CyclinB1表达显著降低,细胞周期依赖激酶抑制因子p27的表达显著上调.结论BIX-01294通过抑制G9a的活性,下调H3K9me2水平,从而抑制肝癌细胞HepG2及Huh7的增殖,促进G0/G1的周期阻滞,其机制可能与上调细胞周期依赖激酶抑制剂p27,以及下调细胞周期相关蛋白CyclinB1表达有关.
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胃癌组织中G9a表达的预后意义及其对胃癌细胞增殖和凋亡的影响
目的:探究组蛋白甲基转移酶G9a在胃癌组织中的表达及其与预后的相关性,并观察G9a抑制剂对胃癌细胞增殖和凋亡的影响.方法:通过Kaplan-Meier Plotter和Oncomine数据库分析G9a在胃癌组织中的表达水平及其与预后的相关性.选用人胃癌细胞株SGC-7901和MKN-45为研究对象,Western blotting方法检测细胞中G9a蛋白表达水平,以G9a抑制剂BIX01294处理胃癌细胞,观察细胞形态变化,CCK-8法和集落形成实验检测胃癌细胞增殖能力和集落形成率的变化,流式细胞术检测细胞凋亡的变化.结果:G9a在胃癌组织中高表达(P＜0.01),其高表达与预后不良呈正相关(P＜0.01).BIX01294能使胃癌细胞体积缩小、细胞间连接消失,甚至细胞皱缩、变圆、脱落等.BIX01294能显著抑制胃癌细胞集落形成和胃癌细胞的增殖(均P＜0.05),同时促进胃癌细胞凋亡(P＜0.05).结论:G9a在胃癌组织中高表达,其高水平表达与预后不良呈正相关;抑制G9a的表达可显著抑制胃癌细胞的增殖和促进细胞凋亡.
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组蛋白甲基转移酶G9a抑制剂的研究进展
组蛋白甲基转移酶G9a可以催化组蛋白H3K9发生单甲基化、二甲基化及缓慢的三甲基化,也可以特异性地催化一些非组蛋白如p53的甲基化.G9a参与体内许多生物学过程,并与人类的各种疾病特别是肿瘤的发生和发展密切相关,被认为是一个具有广阔前景的肿瘤治疗新靶标.因此,G9a抑制剂的开发受到广泛关注.综述近10年报道的G9a小分子抑制剂的研究进展,以期为现有抑制剂的临床进展和新型抑制剂的开发提供参考.
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BIX-01294对Molt-4细胞增殖、凋亡及组蛋白甲基化的影响
目的：观察甲基化转移酶G9a抑制剂BIX-01294对急性T淋巴细胞白血病Molt-4细胞增殖、凋亡及组蛋白甲基化的影响。方法 MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞凋亡的变化；Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax、抑癌蛋白P15、DNA去甲基化酶DNMT1、组蛋白H3乙酰化、组蛋白H3K9单、双、三甲基化水平,H3K27单甲基化、双甲基化水平的变化。结果 BIX-01294可下调Bcl-2蛋白、上调Bax蛋白的表达, Caspase-3表达上调,诱导细胞凋亡,浓度为0、1、2、4μmol · L-1的BIX-01294作用Molt-4细胞24 h 后,凋亡率分别为(5．54±1．35)%、(10．24±2．26)%、(32．28±3．26)%、(47．52±4．37)%(P<0．05),差异有统计学意义。 BIX-01294抑制DNMT1表达,上调P15蛋白表达,抑制细胞的增殖；BIX-01294下调组蛋白 H3K9、H3K27单甲基化和二甲基化水平,而组蛋白 H3乙酰化及H3K9三甲基化水平无明显改变。结论 BIX-01294通过抑制G9a 的活性,下调 H3K9、H3K27单甲基化、二甲基化水平,抑制DNMT1,使上调P15蛋白,终抑制Molt-4细胞增殖,并诱导细胞凋亡。
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常染色质组蛋白甲基化转移酶与哺乳动物生殖
常染色质组蛋白甲基化转移酶(euchromatin histone lysine methyltransferases,EHMTs)能够使基因组常染色质区域的组蛋白3第9位赖氨酸二甲基化(histone 39th lysine demethylate,H3K9-di).在哺乳动物中有两种EHMT基因编码蛋白,分别为EHMT1编码GLP和EHMT2编码G9a.EHMTs在不同组织和不同细胞分化的过程中扮演不同的角色并且参与到记忆、药物成瘾、免疫反应等成人特异性反应过程的形成.EHMTs及其蛋白在哺乳动物生殖过程中的配子发生、胚胎发育及子宫疾病等方面发挥重要的作用.
关键词： 表观遗传 常染色质组蛋白甲基化转移酶 G9a 生殖发育 -
G9a在肿瘤发展中的作用及研究现状
癌症被认为是一种由遗传突变累积而引发的疾病,涉及多个肿瘤相关基因的变异,如抑癌基因、癌基因、DNA损伤修复基因等发生基因突变或相关表观遗传学变化.近年来研究发现,常染色质组蛋白赖氨酸甲基转移酶G9a,又称EHMT2,在人类多种癌症中表达异常,与肿瘤患者预后不良呈正相关,初步提示G9a可能成为肿瘤治疗的潜在靶点.
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G9a抑制剂在肿瘤中的研究进展
G9a是含有经典SET结构域的组蛋白赖氨酸甲基化转移酶,具有多种生物学功能,包括细胞分化、基因转录和胚胎发育等.G9a介导的H3K9甲基化可以沉默肿瘤抑制因子,促进癌症的发生.越来越多的研究表明,G9a的过表达不仅涉及肿瘤细胞的分化、增殖和上皮间质转化(EMT),还与癌症患者的不良预后密切相关.鉴于G9a在肿瘤发生中的重要作用,G9a已经成为治疗癌症的一个强有力的靶点,引起科研界的广泛关注.本文对G9a的结构与功能、G9a与肿瘤的关系以及近年来报道的G9a抑制剂进行归纳与概述,以期对今后G9a抑制剂的研究提供参考.
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罗勒多糖对缺氧条件下肝癌细胞组蛋白H3K9me2甲基化及G9a、JMJD1A表达的影响
目的:研究罗勒多糖对缺氧条件下肝癌细胞MHCC97H和MHCC97L低氧诱导因子1α(HIF-1α)组蛋白甲基转移酶G9a、去甲基化酶JMJD1A的表达及组蛋白H3 K9me2甲基化水平的影响,探讨罗勒多糖对肝癌细胞表观遗传学的调节作用.方法:采用二氯化钴(CoC12)模拟细胞缺氧,建立肝癌细胞MHCC97H和MHCC97L体外缺氧模型,通过不同浓度罗勒多糖干预24 h,实时荧光定量PCR法检测各组肝癌细胞中HIF-1α、G9a和JMJD1A mR-NA表达水平,Western-blot法检测各组肝癌细胞中HIF-1α、G9a、JMJD1A蛋白表达情况及组蛋白H3 K9 me2甲基化水平.结果:罗勒多糖能下调MHCC97H细胞缺氧条件下HIF-1α、G9a、JMJD1A mRNA和蛋白的表达和组蛋白H3K9me2甲基化水平以及MHCC97L细胞缺氧条件下HIF-1α mRNA和蛋白的表达和组蛋白H3 K9 me2甲基化水平(P＜0.05).结论:罗勒多糖对缺氧条件下不同转移潜能肝癌细胞MHCC97H和MHCC97L组蛋白H3K9me2甲基化水平均有有调节作用,其中对高转移潜能肝癌细胞MHCC97H组蛋白H3 K9me2甲基化的调节与组蛋白甲基转移酶G9a和去甲基化酶JMJD1A有关,而对低转移潜能肝癌细胞MHCC97L组蛋白H3K9me2甲基化的调节可能是通过其他通路发挥作用.
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甲基化转移酶G9a介导的组蛋白修饰事件调控ATF3表达及神经元凋亡
目的 探讨协同c-Jun/ATF2调控ATF3表达的染色质重塑事件及对神经元凋亡的作用.方法 小脑颗粒神经元凋亡刺激后检测组蛋白H3乙酰化水平的变化与ATF3表达的变化.G9a抑制剂BIX-01294处理神经元,Western Blot检测ATF3的表达、H3的甲基化变化,核染色检测神经元的凋亡率.结果 神经元凋亡时诱导ATF3表达,H3第4位赖氨酸乙酰化修饰(methyl-H3-K4)增加.BIX-01294浓度依赖地抑制H3第4位赖氨酸甲基化修饰,抑制ATF3表达,抑制神经元凋亡(P＜0.05).结论 神经元凋亡时,G9a介导的H3第4位赖氨酸甲基化修饰调控ATF3表达及凋亡发生.
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采用药效团模型和分子对接方法筛选新型的组蛋白甲基转移酶 G9a抑制剂
目的：利用药效团模型和分子对接方法对商业化合物库ChemDiv中的G9a focused‐libraries进行筛选，希望发现新骨架结构的G9a抑制剂。方法首先，使用Discovery studio 3．1软件分别构建基于配体的药效团模型和基于配体‐受体复合物的药效团模型，并根据构建的2个模型再重新定义2个新的药效团模型。然后，构建测试集并测试药效团模型的预测能力。后，选取优药效团模型对G9a focused‐libraries进行筛选，对筛选出的化合物使用CDOCKER分子对接进行分析与评价。结果测试结果显示，所构建的药效团模型具有一定的预测能力，通过该药效团筛选得到了2个结构新颖的潜在的G9a抑制剂。结论所构建的药效团模型具有一定的可靠性，虚拟筛选发现的G9a抑制剂还需进一步的实验证明。
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G9a表达抑制对骨肉瘤细胞MG-63增殖的影响
目的:探讨组蛋白甲基转移酶G9a在骨肉瘤中的表达以及靶向抑制G9a活性对于骨肉瘤细胞增殖的影响.方法:采用RT-PCR检测骨肉瘤组织及正常毗邻组织中G9a的表达情况,同时检测骨肉瘤细胞系及正常成骨细胞中G9a的表达.通过MTT及克隆形成试验检测G9a抑制剂BIX-01294对MG-63细胞增殖的影响.结果:G9a在肿瘤组织中表达明显高于正常组织(P＜0.05),且在肿瘤细胞系MG-63及U-2 OS中的表达也高于正常成骨细胞系hFOB1.19 (P ＜0.05).BIX—01294能够显著抑制MG-63细胞的增殖(P＜0.05),而对正常成骨细胞系hFOB1.19的增殖却无明显影响(P＞0.05).结论:G9a在骨肉瘤中高表达,靶向抑制G9a的功能可以抑制肿瘤细胞的增殖,G9a为未来治疗骨肉瘤的潜在靶点.
