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桥粒芯糖蛋白基因沉默对HL-1细胞的影响
目的 探讨桥粒芯糖蛋白(DSG2)基因沉默对HL-1细胞超微结构、细胞凋亡以及纤维化、脂肪化相关基因表达的影响.方法 设计并合成针对DSG2基因编码区的干扰序列,构建真核细胞表达质粒并转染HL-1细胞.荧光定量PCR( RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)技术检测DSG2在mRNA和蛋白水平表达变化,筛选出沉默效率佳的细胞株.观察其超微结构、细胞凋亡和纤维化与脂肪化相关基因mRNA水平表达的改变.结果 成功构建了4种SbDSG2重组质粒,转染HL-1细胞并获得稳定转染细胞株,筛选出对DSG2基因mRNA水平(71.67％对0,P＜0.01)和蛋白水平表达(51.72％对0,P＜0.01)的抑制效率显著的ShDSG2-273组.电镜扫描显示后者细胞空泡样变性、线粒体肿胀和嵴消失,流式细胞仪检查提示细胞凋亡显著增加,RT-PCR示纤维化相关基因(Col1a1、Col1a2、Col3a1)与脂肪化相关基因(Adiponectin、PPAR-γ和C/EBP-α)的mRNA表达显著升高.结论 成功建立能有效抑制DSG2表达的HL-1细胞株,表现出符合致心律失常型右心室心肌病(ARVC)患者病理和分子生物学特点的表型特征,提示其可作为深入研究ARVC致病机制的工具细胞.
关键词： 桥粒芯糖蛋白 RNA干扰 HL-1细胞 致心律失常型右心室心肌病 细胞凋亡 -
HL-1细胞培养及房颤细胞模型的建立
目的:利用HL-1细胞建立快速起搏模型,对心房颤动(atrial fibrillation,AF)早期的重构现象进行初步研究.方法:培养HL-1细胞,建立快速电场刺激起搏细胞模型,利用全细胞膜片钳技术记录刺激前后HL-1细胞的动作电位周期,透射电镜观察细胞超微结构的变化.结果:将细胞接种于培养皿中,72h后细胞呈融合状态,全细胞膜片钳记录培养HL-1细胞及经电场刺激(600次/min,1 V/cm) 24h后的心房肌细胞的动作电位周期,动作电位周期分别为106 ms,45 ms,刺激前后差异有统计学意义(P＜0.05).透射电镜观察到刺激后HL-1细胞超微结构发生去分化改变.结论:经快速起搏24h后,HL-1细胞发生了电及结构重构;利用HL-1细胞建立快速起搏的房颤模型,可以对房颤早期的重构机制进行研究.
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高频电刺激HL-1细胞对线粒体凋亡途径的影响
目的 探讨高频电刺激HL-1细胞对线粒体凋亡途径的影响.方法 Western blot检测对照组(HL-1细胞)和刺激组(25 Hz高频电刺激HL-1细胞24 h)B细胞淋巴瘤/白血病2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶(Caspase)9和Caspase-3的蛋白表达量,细胞线粒体分离试剂盒分离对照组和刺激组HL-1细胞的线粒体和细胞质,Western blot检测细胞色素C(Cyt C)在线粒体内外的表达.结果 与对照组比较,刺激组Bcl-2表达下调,Bax、Caspase-9及Caspase-3表达上调(P＜0.01),线粒体内的Cyt C表达下调,而细胞质内的Cyt C表达上调(P＜0.01).结论 高频电刺激HL-1细胞能够通过激活细胞内的线粒体凋亡途径来促进HL-1细胞凋亡.
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淫羊藿苷对异丙肾上腺素诱导的肥大HL-1心肌细胞维生素D受体mRNA表达的影响
目的 探讨淫羊藿苷对异丙肾上腺素诱导的小鼠肥大HL-1心肌细胞维生素D受体mRNA相对表达量的影响.方法 以2×104·m1-1密度接种细胞,用异丙肾上腺素诱导小鼠HL-1心肌细胞损伤,实验分为正常组、模型组、淫羊藿苷低剂量组、淫羊藿苷中剂量组、淫羊藿苷高剂量组、维生素D组.MTT法检测各组HL-1心肌细胞存活率.Real-Time PCR法检测各组HL-1心肌细胞维生素D受体mRNA相对表达量.结果 MTT法显示不同剂量的淫羊藿苷均可提高小鼠肥大HL-1心肌细胞的存活率,且淫羊藿苷的浓度在10μmol·L-1时,细胞存活率高.Real-Time PCR检测结果显示,与模型组比较,不同剂量的淫羊藿苷均可明显下调(P＜0.05)异丙肾上腺素诱导的小鼠肥大HL-1心肌细胞维生素D受体mRNA相对表达量.结论 淫羊藿苷对小鼠肥大HL-1心肌细胞具有保护作用,其机制可能通过维生素D轴调节VDR mRNA表达水平有关.
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黄芪甲苷对异丙肾上腺素诱导的肥大HL-1心肌细胞维生素D受体mRNA表达的影响
目的 探讨黄芪甲苷对异丙肾上腺素诱导HL-1心肌细胞活性及维生素D受体mRNA相对表达量的影响.方法 用异丙肾上腺素(isoproterenol,ISO)10μmo1·L-1诱导HL-1心肌细胞损伤的模型,随机分为5组:正常组,模型组,模型组+黄芪甲苷(3μmol·L-1)(即黄芪甲苷低剂量组),模型组+黄芪甲苷(10μmol·L-1)(即黄芪甲苷中剂量组),模型组+黄芪甲苷(30μmol·L-1)(即黄芪甲苷高剂量组).运用MTT法检测心肌细胞的存活率.RT-PCR检测维生素D受体mRNA的相对表达量.结果 ISO处理HL-1心肌细胞,不同浓度的黄芪甲苷可提高心肌细胞的活性,且黄芪甲苷的浓度在30μmo 1·L-1时,保护作用好.RT-PCR检测结果显示,不同剂量的黄芪甲苷VDR基因相对表达量与模型组相比,其表达明显下调(P＜0.05).结论 黄芪甲苷对HL-1心肌细胞损伤具有保护作用,其机制可能通过维生素D轴调节VDR基因表达水平有关.
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自体心肌细胞移植、hTERT与心肌细胞永生化
解决自体心肌细胞移植细胞来源问题的策略之一是实现心肌细胞永生化.本文对永生化的心肌细胞:AT-1细胞,HL-1细胞,心脏干细胞以及hTERT与心肌细胞永生化的关系作一综述.
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巨噬细胞移动抑制因子对HL-1细胞T型钙电流的调控
目的 观察巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)对心房肌细胞T型钙电流(T-type calcium channel current,ICa,T)的调控.方法 使用全细胞膜片钳和分子生物分析方法检测心房肌细胞ICa,T的表达.结果 在体外培养的心房肌细胞株(HL-1细胞)中,小鼠重组MIF(20、40 nmol/L,24 h)可明显抑制ICa,T的峰值电流,与对照组比较,差异均有统计学意义[峰值内向电流:(-17.5±2.9)pA/pF vs.(-27.9±3.4) pA/pF,P＜0.05;(-11.3±1.7)pA/pF vs.(-27.9±3.4)pA/pF,P＜0.01]；并可损伤电压依赖的ICa,T激活,使T型钙通道α1G和α1H亚单位mRNA表达下调.而Src非特异性抑制剂genistein和特异性抑制剂PP1可逆转40 nmol/L MIF所致的ICa,T下调[genistein:(-11.3±1.7)pA/pF vs.(-16.1±0.8),P＜0.05；PPI:(-11.3±1.7)pA/pFvs.(-19.0±3.2)pA/pF,P＜0.05].结论 MIF可能通过影响ICa,T参与心房颤动的病理过程,Src可能参与该信号转导途径.
关键词： 心房纤颤 巨噬细胞移动抑制因子 T型钙电流 HL-1细胞 -
HL-1心肌细胞中桥粒蛋白基因表达下调对Nav1.5功能的影响
目的 采用基因沉默技术抑制HL-1细胞的桥粒蛋白(DSP)基因表达以明确DSP与Nav1.5的结构和功能关系.方法 用基因沉默技术抑制DSP基因的表达,然后采用Western blotting检测HL-1细胞DSP和Nav 1.5蛋白的表达,用双免疫荧光方法检测DSP与Nav1.5蛋白的表达与定位情况,并用全细胞膜片钳技术检测细胞钠通道的电生理特征.结果 与空白组和对照组相比,siRNA-DSP组的DSP和Nav1.5蛋白表达量降低.免疫荧光检测发现空白组和对照组DSP与Nav1.5蛋白存在共定位情况,而siRNA-DSP组DSP和Cx43蛋白共定位则遭到破坏,并且膜片钳检测发现siRNA-DSP组峰值电流从(156.3±6.2) pA/pF减少至(41.8士3.1)pA/pF(P＜0.05),电压依赖的失活曲线V0.5从-42 mV左移至-61 mV(P＜0.05)和从失活恢复时间延长.结论 DSP表达抑制不仅使DSP与Nav1.5的共定位特征遭到破坏,而且还改变了Nav1.5电生理特征.
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SHP-1在Ang-(1-7)拮抗AngⅡ致心房肌缝隙连接蛋白43重构中的作用
目的 探讨血管紧张素1-7[angiotensin 1-7,Ang-(1-7)]是否通过SHP-1来抑制血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导的c-Src激活,从而改善缝隙连接蛋白43(connexin 43,Cx43)的表达以及功能.方法 以小鼠心房肌细胞系(HL-1细胞系)作为研究对象,分为Control组、AngⅡ组、AngⅡ+SU6656(c-Src抑制剂)组、AngⅡ+Ang-(1-7)组、AngⅡ+Ang-(1-7)+SSG(SHP-1抑制剂)组,Western blot分别检测p-c-Src、Cx43、SHP-1的表达,细胞免疫荧光、划痕标记染料示踪技术观察Cx43空间分布以及缝隙连接功能.结果 与Control组比较,高浓度AngⅡ(10-mol/L)干预后p-c-Src表达增加(P＜0.01),Cx43表达降低(P＜0.05),Cx43传导距离缩短;SU6656和Ang-(1-7)预处理可抑制AngⅡ诱导的c-Src激活,Cx43表达增加(P＜0.05),Cx43传导距离增加;同时Ang-(1-7)预处理明显地促进SHP-1的表达增加(P＜0.05).与AngⅡ+Ang-(1-7)组比较,AngⅡ+Ang-(1-7)+SSG组SHP-1表达降低(P＜0.05),p-c-Src表达增加(P＜0.01),细胞Cx43表达降低(P＜0.05),Cx43传导距离缩短.结论 Ang-(1-7)通过增加SHP-1表达从而抑制c-Src活性,进而发挥对AngⅡ的拮抗作用,使Cx43表达上升并改善缝隙连接功能.
