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17β-雌二醇对ApoE-/-鼠Teff/Treg细胞平衡和氧化应激的影响及与动脉粥样硬化的关系
目的 探讨不同时间给予17β-雌二醇(E2)替代治疗对apoE-/-雌鼠动脉粥样硬化(As)病变内效应性T细胞(Teff)和调节性T细胞(Treg)平衡和氧化应激的影响及其与As的关系.方法 5周龄apoE-/-鼠摘除卵巢后用高脂餐喂养,随机分为早期、延迟及持续治疗组,给予E2皮下注射(5μg/天)8周或16周,检测主动脉根部As病变大小、组成改变以及硫氧还蛋白TRX1的表达,并检测As病变内Th1细胞的细胞因子IFN-γ、Treg细胞的转录因子Foxp3和TRX1 mRNA的表达.结果 (1)和对照组相比,早期E2治疗使apoE-/-鼠脂质条纹的面积显著减少(8.82％土0.98％ vs.19.3％±1.26％ in controls,P＜0.01);而延迟E2治疗纤维脂质斑块的面积明显增加(30.7％±0.74％ vs.25.1％±0.94％ in controls,P＜0.05);持续E2治疗纤维脂质斑块的面积亦明显降低(22.48％±0.92％vs.25.63％±1.04％ in controls,P＜0.05);(2)延迟E2治疗斑块内胶原和平滑肌细胞含量明显减少,而巨噬细胞数量显著增加;持续E2治疗斑块内胶原和平滑肌细胞含量明显增加,而巨噬细胞数量明显减少;(3)早期及持续E2治疗As病变内代表促炎作用的IFN-γmRNA的表达明显降低,而延迟E2治疗斑块内IFN-γ mRNA的表达明显增加;(4)早期及持续E2治疗AS病变内代表抑炎作用的Foxp3mRNA的表达明显增加,而延迟E2治疗斑块内Foxp3 mRNA的表达明显降低;(5)早期及持续E2治疗,apoE-/-鼠血清过氧化脂质(LPO)的含量明显减少,而延迟E2治疗血清LPO含量明显增加;(6)早期及持续E2治疗As病变内TRX1 mRNA及蛋白水平的表达明显降低;而延迟E2治疗斑块内TRX1 mRNA及蛋白水平的表达却明显增加.结论 apoE-/-鼠摘除卵巢后,早期E2替代治疗可抑制As病变的形成,而缺乏雌激素一定时间后,再给予E2治疗却加速了As病变的进展并使斑块趋于不稳定,其机制与调节Teff/Treg细胞平衡以及对氧化应激的影响有关.
关键词： 17β-雌二醇 ApoE-/-鼠 Teff/Treg细胞 动脉粥样硬化 氧化应激 -
miR-124及其启动子区DNA甲基化在同型半胱氨酸致动脉粥样硬化中的作用
本文旨在探讨miR-124在同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)致动脉粥样硬化中的作用及其启动子区DNA甲基化调控机制.ApoE-/-小鼠给予高蛋氨酸饮食16周复制高同型半胱氨酸血症动物模型,并设正常对照组(C57BL/6J小鼠正常饮食)及ApoE-/-对照组(ApoE+小鼠正常饮食).HE及油红O染色后观察各组小鼠主动脉粥样硬化程度;生化分析仪检测各组小鼠血清Hcy及血脂水平;复制泡沫细胞模型,油红O染色确定模型是否复制成功;分别以0、50、100、200、500 μmol/L Hcy及50μmol/L Hcy+ 10 μmol/L5-氮杂胞苷(AZC)干预细胞.实时定量PCR (RT-qPCR)检测各组小鼠主动脉及泡沫细胞中miR-124的表达变化;巢式降落式甲基化特异性PCR (nMS-PCR)检测各组小鼠主动脉及泡沫细胞中miR-124启动子区DNA甲基化水平,同时在细胞水平观察DNA甲基化抑制剂AZC对miR-124启动子区DNA甲基化水平及其表达的影响;泡沫细胞油红O染色观察miR-124甲基化改变对细胞脂质蓄积的影响.结果显示,与ApoE-/-对照组相比,高蛋氨酸组小鼠血清Hcy水平显著升高(P＜0.01),且主动脉发生明显粥样变,miR-124的表达水平显著降低(P＜0.01),而miR-124启动子区DNA甲基化水平显著升高(P＜0.01).给予不同浓度Hcy刺激泡沫细胞后,miR-124的表达水平呈下降趋势,而miR-124启动子区DNA甲基化水平逐渐升高,且随Hcy浓度增加改变越明显,呈剂量依赖关系(P＜ 0.05,P＜ 0.01),给予AZC干预后可逆转上述变化(P＜0.05).以上结果提示,miR-124表达下调可能在Hcy致动脉粥样硬化过程中发挥重要作用,而miR-124启动子区高甲基化改变可能是其表达下调的重要机制.
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高同型半胱氨酸血症经内质网途径影响ApoE-/-鼠肝细胞凋亡
目的 观察高同型半胱氨酸血症(HHcy)对ApoE-/-鼠肝细胞凋亡的影响并探讨其可能机制.方法 36只ApoE-/-小鼠随机分为3组,每组12只:① ApoE-/-对照组(ApoE-/- group):普通饮食饲养;②蛋氨酸饮食组(methionine diet group):普通饮食+1.7%蛋氨酸饲养;③干预组(treatment group):普通饮食+1.7%蛋氨酸+0.006%叶酸及0.0004% VitB12饲养.另取12只正常C57 BL/6J小鼠给予普通饮食,作为正常对照组(normal control group).饲养20周后,ELISA测定血清同型半胱氨酸(Hcy)浓度和肝组织Caspase-12含量;全自动生化分析仪测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性;DAPI染色法观察肝组织细胞核形态;电镜观察肝脏组织细胞超微结构.结果 与正常对照组和ApoE-/-对照组相比,蛋氨酸饮食组Hcy浓度分别增高2.4倍(P<0.01)和2.5倍(P<0.01);ALT活性分别增高2.0倍(P<0.05)和1.2倍(P<0.05);各组AST活性无明显差异;肝组织切片DAPI染色及电镜结果显示,蛋氨酸饮食组小鼠肝细胞出现凋亡的形态学改变,蛋氨酸饮食组小鼠肝细胞线粒体肿胀、浓缩,内质网大量增生,可见细胞凋亡前体及凋亡小体;Caspase-12活性检测显示蛋氨酸饮食组较正常对照组增高(P<0.05).与蛋氨酸饮食组比较,干预组小鼠血清Hcy浓度降低,Caspase-12活性下降,肝细胞病理变化减轻,血清ALT活性明显降低.结论 HHcy可能通过影响ApoE-/-鼠内质网功能改变,引起肝细胞凋亡.
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HHcy对ApoE-/-鼠动脉粥样硬化的影响及叶酸、VB12的干预效应
目的 探讨高同型半胱氨酸血症(HHcy)对ApoE-/-鼠动脉粥样硬化(AS)形成的影响及叶酸、维生素B12( VB12)的干预效应.方法 健康5周龄雄鼠(SPF级C57BL/6J)作为对照组,饲以普通饮食.另选5周龄雄性纯合子ApoE-/-鼠(SPF级近交系C57BL/6J )36只,随机平均分为高脂血症组、HHcy组、干预组.喂养14周后,取血测定血清Hcy及血脂水平,取主动脉进行石蜡包埋并切片,HE染色后检测主动脉斑块面积及内中膜厚度.结果 HHcy组血清同型半胱氨酸(Hcy)水平明显高于对照组与干预组(P＜0.001),与对照组比较,其血脂LDL、TG、CHOL分别升高约2.2、7.6、7.2倍,HDL下降约63％(P ＜0.001).HE染色可见三组ApoE-/-鼠均有AS斑块形成,HHcy组主动脉斑块面积6.21×105μ m2明显大于高脂血癌组3.99×10sμ m2与干预组4.41×105μm2(P ＜0.05).AS斑块面积与其血清Hcy水平呈正相关(r=0.4898,P＜0.001).结论 HHcy导致ApoE-/-鼠AS病变形成,且病变程度依赖血清Hcy水平,叶酸和VB12的干预可有效缓解HHcy引起的血管损伤.
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尿毒症ApoE基因敲除小鼠加速发展的动脉粥样硬化与体内T细胞(Treg/ Teff)平衡的关系
目的 建立尿毒症apoE-/-小鼠的动物模型,探讨模型鼠主动脉加速发展的动脉粥样硬化与体内T细胞(Treg/Teff)平衡的关系.方法 选用C57BL/6J遗传背景的apoE-/-鼠为研究对象,通过右肾皮质电凝加左肾切除术建立尿毒症apoE-/-鼠模型,对照apoE-/鼠行假手术.造模后2周检测肾功能判断造模是否成功.造模后10周采血检测肾功、血清总胆同醇;应用ELISA法检测血清TGF-β_1及IFN-γ浓度;应用流式细胞术检测脾脏CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg细胞比率;应用实时荧光定量PCR法检测主动脉组织中Foxp3及IFN-γ mRNA的表达;收集主动脉根部行冰冻切片油红O染色计算斑块相对面积.分析肾功能指标与Treg数量的相关性.结果 造模后肾功能检测显示造模成功.造模后10周与对照组apoE-/鼠相比:尿毒症apoE-/-鼠主动脉根部动脉粥样硬化斑块相对面积显著提高,脾脏Treg细胞比率下降,血清TGF-β_1浓度降低及IFN-γ、总胆固醇浓度升高,主动脉Foxp3 mRNA表达下调及IFN-γ mRNA表达上调.肾功能指标与Treg数量呈显著负相关.结论成功地建立了尿毒症apoE-/-小鼠模型.模型鼠主动脉加速发展的动脉粥样硬化与体内Treg数量减少、功能受损及Teff功能上调,即T细胞亚群(Treg/Teff)失衡有关.
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CFTR抑制ApoE－／－鼠高同型半胱氨酸血症诱导的肝损伤
目的：探讨囊性纤维化跨膜转导调节因子（CFTR）在高同型半胱氨酸血症（HHcy）致 ApoE－／－鼠肝损伤中的作用。方法：5周龄雄性 ApoE－／－鼠36只随机分为模型对照组、模型组和治疗组，分别给予普通、高蛋氨酸、高蛋氨酸加叶酸饮食，C57BL／6J 雄鼠12只，普通饮食，为正常对照组。检测小鼠血清 Hcy、ALT和AST 变化，Hcy（100μmol／L）及100 Hcy ＋ F （100μmol／L Hcy ＋叶酸）干预肝细胞后，检测肝组织和细胞内 CFTR mRNA 和蛋白水平，分析 CFTR 激动剂（VX-770）与抑制剂[CFTR（inh）-17]干预细胞后对CFTR 表达及 ALT 和 AST 含量的影响。结果：模型组 ApoE－／－鼠血清 Hcy、ALT 和 AST 显著升高， CFTR表达下降（P ＜0．05），而治疗组可拮抗 Hcy、ALT、AST、CFTR 的改变（P ＜0．05）；Hcy （100μmol／L）引起肝细胞 CFTR 表达降低而 ALT 和 AST 升高（P ＜0．05），叶酸对这一改变起缓解作用。 VX-770和 CFTR （inh）-17干预后可改变肝细胞内ALT 和AST 含量。结论： CFTR 通过调控 ALT 和 AST 抑制 HHcy 致肝细胞损伤过程。
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Hcy对动脉粥样硬化小鼠肝脏脂质代谢的影响
目的：探讨同型半胱氨酸（Hcy）促进ApoE基因敲除（ApoE-/-）鼠动脉粥样硬化（AS）形成同时是否对肝脏脂质代谢产生影响。方法取健康5周龄雄鼠（SPF级C57BL/6J）12只作为正常对照组，饲以普通饮食；另选5周龄雄性纯合子ApoE-/-鼠（SPF级近交系C57BL/6J）36只，分为模型对照组、高同型半胱氨酸血症（H Hcy ）组、叶酸和VB12干预的干预组，每组12只，饲养18周后，生化分析仪测定血清Hcy及血脂总胆固醇（CHOL）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）水平，主动脉冰冻切片苏木素-伊红（H E ）染色后观察并测量斑块面积；肝脏组织冰冻切片油红O染色观察肝脏细胞脂质变化，酶法测定肝脏脂质代谢改变。结果与正常对照组比较，HHcy组血清Hcy、LDL、TG、CHOL水平明显增高（P＜0．01），分别升高约2．3、2．8、5．0、10．7倍，HDL下降约64％（P＜0．01）；干预组Hcy、LDL、CHOL水平较 HHcy组分别下降43％、34％、21％，HDL水平增高36％（P＜0．05），TG无明显变化；HE染色可见3组ApoE-/-鼠主动脉均有 AS形成，其中 HHcy组主动脉斑块面积28．2×104μm2，明显大于模型对照组的17．0×104μm2（P＜0．05），干预组斑块面积17．1×104μm2，较 HHcy组减轻（P＜0．05）。肝脏油红O染色HHcy组脂质积累明显；干预组肝细胞内有少量脂质沉积；氧化酶法检测发现 HHcy组肝脏组织中CHOL和TG分别是正常对照组的2．2、2．8倍（P＜0．01）；干预组肝脏CHOL、TG水平与 HHcy组比较下降30％、33％（P＜0．01）。结论 Hcy促进ApoE-/-鼠AS形成的同时加速肝脏脂代谢紊乱。
