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Bcclin1基因慢病毒载体的鉴定包装及其在银杏酮酯保护衰老海马神经元中的作用
目的:探讨自噬相关基因Beclin1在银杏酮酯保护衰老海马神经元中的作用.方法:使用酶切和DNA测序方法对已构建好的pLVX-shRNA2-Beclin1慢病毒载体进行鉴定,并与辅助包装质粒载体共同转入293T细胞得到病毒颗粒.将病毒颗粒转染原代大鼠海马神经元.培养原代大鼠海马神经元并随机分为6组:正常组、模型组、银杏酮酯组、银杏酮酯干扰组、阳性对照银杏叶提取物组和银杏叶提取物干扰组.正常组用正常培养基培养,模型组用H2 O2(200μM)诱导18小时建立衰老样细胞模型;银杏酮酯和银杏叶提取物组分别用200μg/ml的药物预处理6小时后再加入H2 O2诱导18小时;其余两组在银杏酮酯和银杏叶提取物组基础上分别加入慢病毒载体颗粒.通过荧光定量PCR和免疫印迹方法检测Beclin 1、LC3-Ⅱ和Synthein Ⅰ表达.结果:酶切和DNA测序结果表明重组慢病毒载体pLVX-shRNA2-Beclin1的插入序列正确.用293T细胞包装的重组慢病毒能够感染原代大鼠海马神经元.体外荧光定量PCR结果显示:慢病毒颗粒转染衰老海马神经元后,200μg/ml银杏酮酯和银杏叶提取物干扰组Beclin1 mRNA水平降低.免疫印迹结果显示:与模型组相比,200μg/ml银杏酮酯和银杏叶提取物组Beclin1、LC3-Ⅱ和SynpainⅠ蛋白表达均增加;慢病毒颗粒转染后,200μg/ml银杏酮酯和银杏叶提取物干扰组神经元Beclin1、LC3-Ⅱ和SynpainⅠ蛋白表达明显降低.结论:Beclin1与银杏酮酯(200μg/ml)保护衰老海马神经元有关.
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银杏酮酯对自然衰老大鼠学习记忆及海马、前额叶皮层c-fos、Caspase-3和Caspase-8表达的影响
目的:探讨银杏酮酯(Ginkgo biloba extract,GBE50)对自然衰老大鼠学习记忆及海马、前额叶皮层c-fos、Caspase-3和Caspase-8表达的影响.方法:21月龄大鼠随机分为模型组、银杏酮酯组和阳性药银杏叶提取物组,1月龄大鼠作为正常组.其中正常组和模型组用1％羧甲基纤维素钠灌胃,银杏酮酯组和银杏叶提取物组分别予100 mg/kg的药物灌胃60天.新物体识别实验检测学习记忆,免疫组织化学方法检测海马CA1区和前额叶皮层c-fos和Caspase-8的蛋白水平,免疫印迹方法检测海马和前额叶皮层Caspase-3蛋白表达.结果:新物体识别实验结果显示:与模型组相比,100mg/kg银杏酮酯和银杏叶提取物可使大鼠的分辨指数和优先指数明显升高.免疫组织化学结果显示:与模型组相比,100mg/kg银杏酮酯和银杏叶提取物可使海马CA1区和前额叶皮层c-fos表达增加,Caspase-8表达降低.免疫印迹结果显示:与模型组相比,100mg/kg银杏酮酯和银杏叶提取物组可使海马和前额叶皮层Caspase-3蛋白表达下降.结论:100mg/kg的银杏酮酯可以改善自然衰老大鼠学习记忆缺陷,这种改善可能与上调自然衰老大鼠海马和前额叶皮层c-fos表达,降低Caspase-3和Caspase-8蛋白水平有关.
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银杏酮酯抗H2O2诱导衰老海马神经元氧化DNA损伤的作用研究
目的:探讨银杏酮酯(Ginkgo biloba extract,GBE50)抗过氧化氢(H2O2)诱导大鼠衰老海马神经元氧化DNA损伤的作用及人类长寿基因(Silent information regulator 1,SIRT1)在其中的作用机制.方法:培养、鉴定大鼠原代海马神经元.将细胞随机分为4组,正常对照组,H2O2模型组,银杏酮酯组和阳性对照银杏叶提取物(EGB761)组.正常对照组用培养基24小时,模型组用H2O2(200μM)诱导18小时建立细胞衰老样模型,后两组分别用200μg/ml的银杏酮酯和银杏叶提取物预处理6小时后再加入H2O2诱导18小时.细胞免疫荧光方法观察各组神经元中8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)和SIRT1的表达强度;免疫印迹方法检测SIRIl、p53和p21的蛋白水平.结果:光镜下观察培养6～7天时海马神经元逐渐成熟,免疫荧光鉴定神经元纯度达到90％以上.细胞免疫荧光结果显示:与正常对照组相比,H2O2诱导的大鼠原代衰老海马神经元中8-OHDG表达增加(P＜0.01),SIRT1的表达降低(P＜0.01).200μg/ml银杏酮酯和阳性对照银杏叶提取物预处理后8-OHDG表达减少(P＜0.05),SIRT1的表达增加(P＜0.05).免疫印迹结果显示:与正常对照组相比,H2O2诱导的大鼠原代衰老海马神经元中SIRT1蛋白表达下降,p21蛋白表达增加(P＜0.05);200μg/ml银杏酮酯和阳性对照银杏叶提取物预处理后H2O2诱导的海马神经元SIRTl蛋白表达增加(P＜0.05),p21蛋白表达下降(P＜0.05);而p53蛋白变化不明显(P＞0.05).结论:200μg/ml的银杏酮酯可降低H2O2诱导的大鼠原代衰老海马神经元内8-OHDG表达,其机制可能与SIRT1、p21蛋白表达有关.
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银杏酮酯对抑郁大鼠行为及炎症细胞因子的影响
目的:研究银杏酮酯(GBE50)对抑郁大鼠行为、血清和海马内炎症细胞因子含量的影响以探讨GBE50防治抑郁症的作用及机制.方法:将雄性SD大鼠随机分为6组,即空白对照组、模型组、氟西汀组(10mg/kg)以及GBE50(35、70和140mg/kg)组.采用孤养结合慢性不可预见性应激抑郁模型,每日给予一种应激刺激,共21d.在应激的同时每日灌胃给药,每周监测体重,造模结束后进行糖水偏爱度实验检测,之后腹主动脉取血、分离海马组织,ELISA法检测各实验组血清和海马炎症细胞因子的含量.结果:模型组体重明显低于空白对照组,各用药组体重与模型组之间没有明显区别,但GBE50各剂量组体重较模型组有增长的趋势.模型组糖水偏爱度明显高于空白对照组;与模型组相比,氟西汀组和GBE50(70和140mg/kg)组明显降低.模型组血清和海马内TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明显高于空白对照组,血清IL-10水平明显低于空白对照组,而海马内IL-10水平明显高于空白对照组.与模型组相比,GBE50各剂量组血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平以及氟西汀组血清TNF-α、IL-6水平均有不同程度降低;海马内GBE50(70和140mg/kg)组以及氟西汀组这些促炎症细胞因子以及IL-10的水平均明显下降.结论:抑郁大鼠体重明显减轻,表现出对糖水的异常偏爱,其血清和海马内促炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量升高,同时血清抗炎症细胞因子IL-10的含量降低,而海马内IL-10水平升高;GBE50可以明显改善模型大鼠抑郁样行为,逆转抑郁大鼠这些血清和海马炎症细胞因子的含量,这可能是GBE50抗抑郁作用的重要机制之一.
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银杏酮酯联合芹菜素预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响
目的:探讨银杏酮酯(ginkgo biloba extract 50,GBE50)联合芹菜素(apigenin)预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用.方法:建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型,选用Sprague-Dawley (SD)大鼠50只随机分为正常组、模型组、银杏酮酯组、芹菜素组、银杏酮酯联合芹菜素组,均按照100 mg/kg灌胃.检测血浆丙二醛(MDA)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白T(cT-nT)、肌酸激酶(CK)和心脏组织超氧化物歧化酶(SOD)和白介素-6(IL-6)变化.同时,取心脏组织HE染色,观察心肌组织的病理变化.结果:与模型组相比,银杏酮酯组100mg/kg、芹菜素组100mg/kg能降低MDA、CK-MB、cTnT、CK、IL-6水平和升高SOD水平;与银杏酮酯组100mg/kg、芹菜素组100mg/kg相比,银杏酮酯联合芹菜素组100mg/kg能显著降低MDA、CK-MB、cTnT、CK、IL-6水平和升高SOD水平;与模型组相比,银杏酮酯组100mg/kg、芹菜素组100mg/kg能减轻心肌组织损伤的病理学变化;与银杏酮酯组100mg/kg、芹菜素组100mg/kg相比,银杏酮酯联合芹菜素组100mg/kg能显著减轻心肌组织损伤的病理学变化.结论:与银杏酮酯100mg/kg、芹菜素100mg/kg相比,银杏酮酯联合芹菜素100mg/kg对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有明显的保护作用,这可能与提高心脏组织中SOD水平和降低心脏组织中IL-6水平有关.
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银杏酮酯抗自然衰老大鼠前额叶皮层氧化DNA损伤和延缓端粒长度的作用及其机制探讨
目的:探讨银杏酮酯(GBE50)抗自然衰老大鼠前额叶皮层(prefrontal cortex,PFC)氧化DNA损伤和延缓端粒长度的作用及SIRT1在其中的作用机制.方法:建立自然衰老大鼠模型,用GBE50(100mg/kg)每日灌胃,连续60天.免疫荧光双标观察PFC中8-OHDG的亚细胞定位及表达强度;荧光定量PCR(Real time-PCR)检测PFC全基因组DNA相对端粒长度;Western-blot检测SIRTl、p53和p21的蛋白水平.结果:免疫荧光双标结果显示8-OHDG主要位于PFC神经元胞体中.与青年对照组相比,自然衰老大鼠PFC神经元8-OHDG表达增加,GBE50 (100mg/kg)处理后减少.RT-PCR结果显示:与青年对照组相比,自然衰老大鼠PFC相对端粒长度缩短,GBE50(100mg/kg)处理后相对端粒长度缩短延缓.Western blot结果显示:与青年对照组相比,自然衰老大鼠PFC的SIRTl蛋白表达下降,p21蛋白表达增加;GBE50(100mg/kg)处理后自然衰老大鼠PFC的SIRT1蛋白表达增加,p21蛋白表达有下降趋势;而p53蛋白变化不明显.结论:GBE50 (100mg/kg)可降低自然衰老大鼠PFC内8-OHDG表达,延缓相对端粒长度缩短,其过程可能与SIRT1、p21蛋白表达有关.
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银杏酮酯对压力超负荷大鼠心室重构的影响
目的:通过银杏酮酯作用于腹主动脉不完全结扎所致的大鼠心室重构动物模型,观察银杏酮酯的抗心室重构作用,分析其可能的作用机理.方法:不完全结扎大鼠腹主动脉造成压力超负荷型心室重构模型,假手术组动物除不进行结扎外其他操作与模型动物相同.造模第二天取存活的造模动物随机分为模型对照组、卡托普利40mg/kg、银杏酮酯50mg/kg、银杏酮酯100mg/kg及银杏酮酯200mg/kg.各组动物灌胃给予受试药物或等体积1％羧甲基纤维素钠溶液(1％ CMC),每天给药1次,连续给药28天.末次给药后行右侧颈总动脉插管,测定血流动力学相关指标;测定左心室指数及全心指数;HE染色光镜观察心肌结构.结果:与正常组相比,模型组动物的左心室指数、全心指数明显升高;SBP、DBP、MAP、±dp/dtmax明显升高;心肌纤维增粗,排列紊乱,细胞肿大,细胞核大而深染,细胞间质增多,间隙增宽.与模型对照组相比,卡托普利组左心室指数,全心指数,SBP,DBP明显降低,MAP,±dp/dtmax降低;银杏酮酯100mg/kg可使左心室指数、全心指数明显降低;±dp/dtmax降低;卡托普利组、银杏酮酯100mg/kg的心肌病理损害明显较模型组减轻;而银杏酮酯100mg/kg与卡托普利组相比,左心室指数及全心指数、SBP、DBP、MAP、±dp/dtmax及病理形态学方面均无显著性差异.结论:银杏酮酯100mg/kg能改善压力超负荷大鼠血流动力学指标,降低心脏质量指教,减轻心肌病理损害,在一定程度上可以改善压力超负荷大鼠的心室重构.
关键词： 银杏酮酯 血流动力学 心室重构 左心室指数和全心指数 心肌组织病理 -
银杏酮酯对体外培养SC增殖的影响
目的 观察银杏酮酯(extract of ginkgo biloba leaves,EGb50)对体外培养的乳鼠SC增殖的影响,探讨其促进神经再生的作用机制.方法 取20只3 d龄SD乳鼠坐骨神经,以酶分步消化法分离SC.将纯化的第2代SC分为实验组和对照组,实验组采用终浓度为50.g/mL EGb50的FBS-DMEM培养液培养,对照组采用不含EGb50的FBS-DMEM培养液培养.于培养后1、3、5、7和9 d,采用四唑氮衍生物[2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyi)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide,XTT]法检测吸光度(A)值并绘制生长曲线,流式细胞仪测定细胞周期.另在培养2 d和3 d用3H-胸腺嘧啶核甙(3H-thymine nucleoside,3H-TdR)测定法检测每分钟射线绝对衰变数(disintegration per minute,DPM)值,ELISA双夹心法测定培养液中神经生长因子(nerve growth factor,NGF)含量.结果 培养的SC大多呈梭形及圆形,纯度达900/0以上.XTT法检测对照组培养3 d A值逐渐增加,5 d达较高水平,此后缓慢增加.实验组变化规律与对照组一致,但不同时间点A值均高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01).3H-TdR掺入实验:实验组2、3 dDPM值为1 961.78±231.13及4 601.51±605.08,对照组为1 347.15 4±121.57及3 740.42±158.73,差异均有统计学意义(P＜0.01).实验组和对照组细胞增殖指数分别为18.6%4-3.2%及9.7%4-2.9%,差异有统计学意义(P＜0.01).实验组和对照组SC培养液上清NGF含量分别(0.065 6±0.003 9)ng/mL和(0038 6±0.003 6)ng/mL,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 EGb50有促进SC分裂增殖的作用,可能是其促进周围神经再生的重要机制之一.
