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人巨细胞病毒PPUL44蛋白核定位信号结合多肽氨基酸序列分析
目的寻找与人巨细胞病毒(HCMV)PPUL44蛋白核定位信号(NLS)具有较强结合能力的多肽，研究这些多肽的氨基酸序列特点。方法采用合成的HCMV PPUL44 NLSA和NLSB分别在一个随机多肽文库中筛选出与NLS具有结合能力的克隆，用四色荧光自动测序的方法测定上述克隆的DNA序列，对这些克隆的多肽氨基酸序列进行同源性比较，并与蛋白质文库中已知蛋白的氨基酸序列进行比较。结果与HCMV PPUL44 NLSA具有结合能力的多肽(bNLSApep)的氨基酸序列与细胞输入蛋白Importin a亚单位的氨基酸具有较高的同源序列，其中bNLSApep48氨基酸序列AVVTPVLTEILK与【mportinα亚单位的Arm7区的第18至29氨基酸序列ANIFPVLTEILQ具有极高的相似性；bNLSBpep39氨基酸序列则与lmportin a亚单位的全部8个Arm区的第10至21氨基酸的同源序列相似。结论 HCMV PPUL44 NLSA可能是lmportin α亚单位针对HCMV PPUL44蛋白的特异性识别位点，与lmportin a亚单位Arm 7区结合；而HCMV PPULA4 NLSB则为lmportin a亚单位的非特异性识别位点。本研究结果提供了lmportin a亚单位的Arm重复区是NLS结构结合区的实验证据。
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TNF-α的合成分泌机制不同于一般的分泌型蛋白
目的 拟借助微粒体膜和体外转录翻译系统来研究分泌型TNFα(S-TNF-α)的产生机制及S-TNF-α和跨膜型TNFα(TM-TNF-α)的关系.方法 首先将分子量为17×103 S-TNF(不含编码TNF信号肽的基因)、26×103 TM-TNF(含信号肽基因)和17×103 S-TNF突变体(S-TNFm,用IL-2信号肽密码子置换TNF信号肽序列)的全长cDNA片段分别亚克隆于含T7启动子的pGEM-3Zf载体,然后利用体外转录翻译系统,在微粒体膜存在和不存在的情况下,体外翻译合成S-TNF、TM-TNF及其S-TNFm.结果 经Western blot 分析结果表明:微粒体的存在并不改变26×103 TM-TNF的分子量,但微粒体的存在能将S-TNFm上的IL-2信号肽切除,证实TNF引导序列与一般分泌性蛋白的"信号肽"不同,在粗面内质网翻译过程中不被切除.进一步酶切分析表明TM-TNF是通过某些金属蛋白酶酶解作用而被转换成S-TNF的.结论 实验结果提示17×103 S-TNF产生机制可能是:TNF产生细胞经LPS等激活后,导致TNF基因转录翻译增加,首先形成26×103 TNF,并借助其信号肽疏水氨基酸部分将之"锚定"在细胞膜,成为跨膜型TNF,介导细胞与细胞之间的生物学效应;在某些蛋白酶作用下,可将mTNF的"信号肽"切除,产生17×103分泌型TNF,释放至体液中,在局部或全身发挥作用.
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人内皮抑素与IL3信号肽融合蛋白真核表达载体的构建
目的构建IL3信号肽与内皮抑素融合蛋白基因的真核表达载体.方法用PCR方法扩增IL3信号肽序列和人内皮抑素基因,然后采用重叠延伸PCR拼接的方法将两者拼接和扩增.并将IL-3-endo cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中.结果IL-3-endo融合蛋白基因包括了IL3信号肽序列和人内皮抑素蛋白全长基因,基因总长度约701bp,被正确拼接,并克隆到pcDNA3.1(+)的CMV启动子下游序列分析证实克隆序列、插入方向和读码框架均正确.结论成功的将IL3信号肽序列连接到人内皮抑素基因序列前并构建了其真核表达载体,为以后的内皮抑素用于基因治疗打下了基础.
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人源性角质细胞生长因子(KGF)的克隆及其表达分析
目的:克隆出正确的人源性角质细胞生长因子(KGF)并探讨影响其表达的因素.方法:应用RT-PCR技术克隆出KGF基因,并用pBV220表达质粒对其进行表达,然后用RNAdraw对其RNA进行分析.结果:带有信号肽的KGF基因在pBV220中表达量为10%左右,而去掉信号肽的KGF基因在pBV220中表达量估计只有1%～2%;利用RNAdraw分析的结果表明前者RNA前端没有形成茎环结构,而后者则形成了茎环结构.结论:KGF基因在细菌中表达量较低,信号肽是影响其表达量的重要因素.
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分泌型人白细胞介素18重组质粒的构建及其真核表达
目的构建带IL-12 P40信号肽序列的分泌型IL-18质粒,使其在真核细胞中稳定表达.方法根据IL-12 P40的信号肽cDNA序列及人成熟IL-18序列设计4条特异性引物,用RT-PCR法自人树突状细胞中分别扩增IL-12 P40信号肽序列(片段A)及成熟IL-18基因(片段B),用重叠延伸PCR法拼接和扩增融合基因(片段C),连接制备pGEM-T克隆载体,亚克隆至pcDNA3.1+.转染NCI-H460人肺癌细胞株,经RT-PCR和Western blot检测IL-18的表达.结果表达质粒的酶切图谱符合预期的结果,测序结果与预期的cDNA序列完全一致,转染细胞株表达了IL-18.结论成功地构建了含IL-12 P40信号肽序列的IL-18表达质粒,并在人肺癌细胞株中得到了表达.
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人CEA信号肽-EK位点-HBD2融合基因的构建
目的构建人CEA信号肽-EK激酶-HBD2抗菌肽融合基因.方法 PCR方法将CEA信号肽、EK激酶识别位点序列、上下游酶切位点及保护性碱基克隆在一个片段上,酶切后,T4 DNA连接酶将此片段定向连接在含HBD2基因片段的pBluescript SK质粒上,构建成人CEA信号肽-EK激酶-HBD2抗菌肽融合基因pBluescript SK载体.结果融合基因经琼脂糖电泳、测序正确.结论成功构建了人CEA信号肽-EK激酶-HBD2抗菌肽融合基因pBluescript SK克隆载体.
关键词： 信号肽类 重组融合蛋白质类/遗传学 基因表达 -
神经元细胞信号传导蛋白质14-3-3ζ编码基因的扩增和克隆
目的克隆神经元信号传导蛋白质14-3-3ζ编码基因,以研究其在人神经退行性病变中的诊断价值、细胞信号传导过程中的作用及对细胞分裂、细胞凋亡的影响.方法提取人脑胶质瘤细胞总mRNA,以其为模板逆转录合成cDNA第一链,设计合成引物,用PCR扩增14-3-3ζ基因编码序列,将其插入pGEM-T载体,并用双酶切和以质粒为模板的PCR进行鉴定.结果 RT-PCR扩增出一条约750 bp大小的特异性条带,重组质粒的双酶切和以质粒为模板的PCR获得了一条与RT-PCR大小相同的条带.经DNA测序证明所克隆的DNA片段与GenBank收录序列一致.结论信号传导蛋白质14-3-3ζ重组pGEM-T克隆载体的成功构建,为进一步研究提供了条件.
关键词： 克-亚二氏综合征/遗传学 信号肽类 克隆 分子 -
细胞质膜微囊-微囊蛋白及其相关信号分子
信号转导是近年来细胞生物学研究十分活跃的领域。这种信号转导过程主要是在生物 膜上进行的，而究竟是在生物膜的什么部位，一直是大家关注的问题。细胞质膜微囊（cave olae,cle）和微囊蛋白(caveolin,cln)的发现为研究信号转导提供了一个重要线索。 随着研究的不断深入，尤其是实验方法的不断成熟从而能够大量获取cle这一特异性质膜 以及对其包被蛋白质cln认识增加，人们逐渐认识到cle是细胞信号转导和加工中心，在基础 状态或膜表面特异性受体激活状态下，与信号转导有关的受体、激酶、联接蛋白等在cle膜 区域高度富集，并且cln还在功能上调控这些信号转导分子的活化状态，参与跨膜信号转导 调节，从而使之更加迅速、准确而有效。本文主要对cle-cln结构功能特点及其对相关信号 转导分子的功能调节作一综述。
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重组人白介素2卡介苗的构建及表达
采用聚合酶链反应及基因工程技术,克隆卡介苗(BCG)的主要分泌抗原Ag85B基因的5'端第94～211的核苷酸的信号肽序列和构建重组人 IL-2 穿梭表达质粒,并用酶联免疫吸附法(ELISA)鉴定外源基因在BCG中的表达.结果表明,构建的BCG重组体能表达和分泌人 IL-2.此将试用于临床治疗膀胱癌病人.
