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Pkm2-shRNA真核表达载体的构建和对急性早幼粒细胞白血病耐药细胞株的作用研究
本研究旨在构建M2型丙酮酸激酶(M2-pyruvate kinase;PKM2)的小发夹结构BNA(shRNA)的真核表达载体,研究特异性沉默pkm2基因对急性早幼粒细胞白血病(APL)耐药性的影响.设计pkm2基因的3个特异shRNA序列,利用基因重组技术将其克隆到含有U6启动予的PBSU6载体上,通过酶切和测序等方法鉴定重组质粒的正确性.利用Western blot方法检测了pkm2-shRNA对急性早幼粒细胞白血病耐药细胞株NB4R2细胞内源性M2-PK蛋白表达的影响,通过NBT还原实验检测了pkm2基因沉默后NB4R2细胞分化情况.结果表明:成功构建了3个有效特异的pkm2-shRNA,在蛋白水平上证明了其对NB4R2细胞M2-PK基因沉默的有效性.发现干涉M2-PK基因后,可显著地促进耐药细胞NB4R2细胞的分化.结论:DNA载体途径的pkm2-shRNA能促进早幼粒细胞白血病细胞的分化,具有基因靶向药物开发前景.
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靶向siRNA下调人结直肠癌Colo320细胞端粒长度与端粒酶逆转录酶基因表达的研究
目的:探讨发夹状shRNA封阻原癌基因(C-myc),抑制癌细胞增殖、生长的作用.方法:针对c-myc的构建发夹状shRNA的真核表达质粒,并转染人结直肠癌Colo320细胞.荧光定量RT-PCR 检测c-myc及细胞端粒酶逆转录酶的mRNA的表达,Western-blot检测c-myc、端粒酶逆转录酶(hu-man telomerase reverse transeriptase,hTERT)蛋白表达水平.Southern blot检测端粒的长度.PCR-ELISE法检测端粒酶活性.3 H-thymidine实验分析DNA合成和细胞增殖.结果:转染细胞增殖、生长皆受到抑制.同时c-myc和hTERT的mRNA和蛋白表达显著下降,端粒的长度明显缩短.端粒酶活性降低.结论:c-myc的shRNA对人结直肠癌Colo320细胞的生长增殖、端粒长度、端粒酶活性有特异性抑制作用,并呈剂量依赖关系.
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c-myc靶向siRNA抑制人结直肠癌Colo320细胞的增殖及下调hTERT基因表达的研究
目的 探讨发夹状shRNA封阻c-mye基因,抑制人结直肠癌Colo320细胞增殖、生长的状况.方法 针对原癌基因e-myc构建发夹状shRNA的真核表达质粒,并转染人结直肠癌Colo320细胞.荧光定量RT-PCR检测c-myc及细胞端粒酶逆转录酶的mRNA表达,Westemn-blot检测c-myc、hTERT蛋白表达水平.Southern blot检测端粒的长度,PCR-ELISE法检测端粒酶活性.3H-thymidine实验分析DNA合成和细胞增殖.结果 转染细胞增殖、生长皆受到抑制.同时,c-myc和hTERT的mRNA和蛋白表达显著下降,端粒的长度明显缩短,端粒酶活性降低.结论 c-myc的shRNA对人结直肠癌Co1p320细胞的增殖、端粒长度、端粒酶活性有特异性抑制作用,并呈剂量依赖关系.
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PCNA的shRNA的真核表达载体的构建及对子宫颈癌细胞的干预性研究
目的 构建PCNA的小发夹结构RNA(shRNA)的真核表达载体并在Hela细胞表达,同时观察PCNA的shRNA对人Hela细胞株体外增殖的影响及生物学特性的改变.方法 将PCNA的cDNA的shRNA引物插入真核表达载体pGenesil-1,构建真核表达质粒pGenesil-1-PCNA1-4,并通过酶切和测序等方法进行鉴定,将真核表达质粒pGenesil-1-PCNA1-4转染子宫颈癌细胞,运用Western blot检测PCNA的蛋白表达,流式细胞仪分析细胞周期变化.结果 PCNA的shRNA能显著抑制人Hela细胞的生长,阻滞细胞G0/G1-S期,PCNA的蛋白表达同时受到抑制.结论 PCNA的shRNA能显著抑制人Hela细胞的生长,其抑制作用可能通过阻断PCNA蛋白表达实现,实验结果为进一步研究PC-NA的shRNA对子宫颈癌的基因治疗奠定了基础.
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PCNA的shRNA对子宫颈癌细胞的抑制研究
目的:构建增殖细胞抗原(PCNA)的小发夹结构RNA(shRNA)的真核表达载体并在 HeLa细胞表达,同时观察PCNA的shRNA对人HeLa细胞株体外增殖的影响及生物学特性的改变.方法:将PCNA的cDNA的shRNA引物插入真核表达载体pGenesil-1,构建真核表达质粒pGenesil-1-PCNA1-4,并通过酶切和测序等方法进行鉴定,将真核表达质粒pGenesil-1-PCNA1-4转染子宫颈癌细胞,运用Western blot检测PCNA的蛋白表达,流式细胞仪分析细胞周期变化.结果:PCNA的shRNA能显著抑制人HeLa细胞的生长,阻滞细胞G0/G1-S期,PCNA的蛋白表达同时受到抑制.结论:PCNA的shRNA能显著抑制人HeLa细胞的生长, 其抑制作用可能通过阻断PCNA蛋白表达实现,实验结果为进一步研究PCNA的shRNA对子宫颈癌的基因治疗奠定了基础.
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靶向siRNA对人子宫颈癌细胞的抑制作用
目的 构建增殖细胞核抗原(PCNA)的小发夹结构RNA(shRNA)的真核表达载体并在人 HeLa细胞表达,同时观察PCNA shRNA对HeLa细胞体外增殖及生物学特性的影响.方法 将PCNA cDNA的shRNA引物插入真核表达载体pGenesil-1,构建真核表达质粒pGenesil-1-PCNA(1-4),并通过酶切和测序等方法进行鉴定,将真核表达质粒pGenesil-1-PCNA(1-4)转染HeLa细胞,运用Western blot方法检测PCNA蛋白的表达,流式细胞仪分析细胞周期变化.结果 PCNA shRNA能显著抑制人HeLa细胞的生长,阻滞细胞于G0/G1期,PCNA的蛋白表达同时受到抑制.结论 PCNA shRNA能显著抑制人HeLa细胞的生长, 其抑制作用可能通过阻断PCNA蛋白表达实现,实验结果为进一步研究PCNA shRNA对子宫颈癌的基因治疗奠定了基础.
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生存素小干扰RNA对人腺样囊性癌ACC-2细胞移植瘤体生长的抑制作用
目的 观察生存素(Survivin)小干扰RNA(siRNA)在体内是否能抑制腺样囊性癌移植瘤体的生长.方法 裸鼠体内注射稳定转染靶向Survivin基因的shRNA真核表达载体pGenesil-shRNA-Survivin后的人腺样囊性癌细胞株ACE-2,观察移植肿瘤生长情况,以空白对照组及阴性质粒对照组作为对照.处死裸鼠后测量移植瘤体积;采用苏木精-伊红染色病理证实移植瘤后,免疫组织化学法检测移植瘤的Survivin蛋白表达情况,半定量RT-PCR检测Survivin mRNA表达情况.结果 处死裸鼠后测量移植瘤体积表明,pGenesil-shRNA-Survivin组移植瘤体积明显减小;其Survivin mRNA及蛋白表达明显降低(P＜0.05).结论 siRNA能在体内明显抑制腺样囊性癌Survivin的表达,Survivin siRNA能有效抑制腺样囊性癌裸鼠体内移植瘤的生长.
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针对HBs基因的shRNA表达载体的构建及鉴定
目的 以PGenesil-1(Pg)为载体构建针对乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因的shRNA表达载体PGenesil-1-HBs(Pgs).方法 设计、合成针对HBs区的三对DNA序列,分别插入PGenesil-1中,并对重组质粒进行限制性内切酶谱和DNA序列测定分析.结果 3个不同的重组shRNA表达载体经限制性酶识别和DNA序列测定完全正确.结论 成功构建了3个针对HBs基因的shRNA表达载体.
关键词： 乙型肝炎病毒 小发夹结构RNA RNA干扰 乙型肝炎病毒表面抗原
