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大鼠外周血间充质干细胞的富集及生物学特性研究
目的:探究大鼠外周血间充质干细胞(PBMSC)的有效富集方法,并进一步研究其生物学特性.方法:采集经G-CSF动员的4周龄SD大鼠外周血,用密度梯度离心法分离出单个核细胞,继而采用贴壁培养法获得成纤维样集落生长细胞,绘制细胞生长曲线;应用流式细胞术(CD90、CD44、CD29、CD45、CD11b和CD79a)和免疫细胞化学染色法(CD73、CD105、CD34和HLA-DR)分析富集的第2代PBMSC的表型特征,并对其进行成骨、成软骨和成脂肪细胞诱导分化能力鉴定.结果:①原代培养6-7d可见明显的成纤维样细胞集落生长,至培养21 d细胞生长汇合度可达80％;传代细胞贴壁能力强,形态均一,呈梭形漩涡状生长;传代培养的PBMSC于培养次日即可进入对数生长期,细胞倍增时间为39.2 h.②富集的PBMSC高表达CD90、CD44、CD29、CD73及CD105,不表达CD45、CD11b、CD79a、CD34和HLA-DR.③PBMSC分别经成骨、成软骨和成脂细胞诱导分化培养21 d后,再分别经茜素红染色显示有大量钙化结节形成,阿利新蓝染色的胞浆内有大量糖胺聚糖形成,油红O染色细胞内有大量脂滴形成.结论:采用本研究方法可从大鼠外周血中分离富集到高纯度、高丰度的PBMSC,且其具备MSC的生长特点和表型特征,并具有中胚层多系分化能力.
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确证家兔外周血中存在具有多向分化能力的间充质干细胞
本研究确证家兔外周血中存在具有多向分化潜能的间充质干细胞(MSC).取成年新西兰大白兔,经每日皮下注射粒细胞集落刺激因子30 μg/kg动员6d后采集外周血样品,用Ficoll密度梯度离心和贴壁培养法分离纯化外周血间充质干细胞(PBMSC),镜下观察其生长形态并绘制增殖曲线；流式细胞术分析其表型特征；并分别对培养的PBMSC进行成骨、成软骨及成脂细胞诱导分化能力鉴定.结果表明:①原代培养24h后,可见较多短梭形及多角形贴壁细胞,3-4d后出现集落样生长,传代培养的PBMSC形态均一、呈长梭形漩涡状生长；②PBMSC增殖能力旺盛,培养2d后进入对数生长期,细胞倍增时间为37.4 h；③流式细胞术检测显示,培养的PBMSC高表达CD29,不表达CD14；④PBMSC经成骨诱导培养21 d后,茜素红染色显示有明显的钙结节形成；经微团无血清软骨培养体系诱导培养21d后,细胞团切片,阿利新蓝染色呈强阳性反应；经成脂诱导培养21 d后,油红染色显示诱导细胞胞浆内有大量脂滴.结论:成功从兔外周血中分离培养了PBMSC,在适宜诱导培养条件下具有向成骨、成软骨、成脂分化的能力.
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低剂量X射线照射对脐带间充质干细胞增殖及成脂成骨分化的影响
目的 探讨低剂量照射对人脐带间充质干细胞(hucMSCs)增殖及成脂、成骨分化的影响.方法 采用组织块贴壁法从人脐带沃顿胶样组织中分离出hucMSCs,并采用流式细胞术检测表面特异性标记.随机分为未予照射的对照组,以及50、100和200 mGy照射组.采用MTT法检测hucMSC在不同照射剂量和不同时间(1～7 d)的增殖情况.取第3代细胞,随机分为照射组(给予200 mGy照射)和对照组(不予照射),在体外诱导其向脂肪、成骨细胞分化,并通过油红O染色、检测碱性磷酸酶(ALP)活性,用RT-PCR检测成骨细胞核结合因子α1的mRNA表达,比较照射组与对照组细胞成脂、成骨分化的不同.结果 9～12 d开始有成纤维细胞从组织块游出贴壁,2周左右达到80%.低剂量照射后2、3、4、5和6 d,不同照射剂量组的细胞增殖均高于对照组(F=159.17、448.81、265.15、183.93、181.83,均P＜0.01),其中以100 mGy组促进细胞增殖作用明显.照射组成脂诱导2 d后细胞内即有脂滴出现,且第21天成脂率明显高于对照组(t=28.25,P＜0.01).成骨诱导后,照射组ALP活性明显高于对照组(t=16.87,P＜0.01),且成骨细胞核结合因子α1的mRNA水平明显增高(t=14.16,P＜0.01).结论 低剂量照射可以促进hucMSC增殖,并加速其向成脂、成骨细胞分化.
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骨质疏松症与骨髓基质细胞
近研究发现各种原因(增龄、去卵巢等)造成的骨质疏松都存在骨量减少和骨髓脂肪增加的现象.在骨质疏松患者中不仅存在骨祖细胞减少,骨髓基质细胞(MSCs)本身的成骨能力也降低.MSCs具有干细胞特性,其细胞分化方向改变,致成骨细胞生成减少,脂肪细胞生成增多可能是老年骨质疏松症的原因之一,其为阐明骨质疏松症的病理机制和研制治疗药物提供了一个新的方向.
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人胎盘羊膜上皮细胞的分离鉴定及多向诱导分化
背景:人羊膜上皮细胞来源稳定,正逐渐成为广受关注的再生医学种子细胞来源.目的:建立人羊膜上皮细胞体外分离培养、成脂、成软骨、成骨诱导分化的方法.方法:通过胰蛋白酶消化法从人胎盘羊膜中分离羊膜上皮细胞,进行体外培养与鉴定,观察培养12 d内的细胞生长曲线.取P1代羊膜上皮细胞,分别进行成脂、成软骨、成骨诱导,以常规培养细胞为对照,诱导16 d后,分别进行油红O染色、Masson染色及碱性磷酸酶染色,同时采用荧光定量PCR检测诱导过程中成脂转录因子、Ⅱ型胶原蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶mRNA表达变化.结果与结论:①从人羊膜中分离出的羊膜上皮细胞,免疫荧光检测表达上皮细胞标记物CK19;②P1代细胞具有较强的分裂增殖能力,P2细胞与P1相比增殖能力略有下降,P3细胞增殖能力差;③羊膜上皮细胞经成脂、成软骨、成骨诱导后,油红O染色有红色脂滴,Masson染色有亮蓝色软骨基质,碱性磷酸酶染色有红褐色钙结节;随着诱导时间的延长,成脂转录因子、Ⅱ型胶原蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶表达量升高;④结果表明,采用酶消化法可从人羊膜中分离得到羊膜上皮细胞,羊膜上皮细胞可向脂肪细胞、成软骨细胞、成骨细胞分化.
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体外定向诱导人羊膜间充质干细胞向骨、软骨及脂肪细胞的分化
背景:人羊膜间充质干细胞属于成体干细胞,在体外不同条件下诱导分化为骨、软骨及其他结缔组织,较其他类型间充质干细胞,因其来源广泛,分离无创伤,较低的免疫原性、生长周期短等特点,是组织工程种子细胞的重要来源.目的:探讨人羊膜间充质干细胞是否具有间充质干细胞特性及诱导成骨、软骨及脂肪细胞诱导分化的能力.方法:取足月产胎盘羊膜组织,酶消化法分离人羊膜间充质干细胞,取第3代细胞分别加入成骨、成软骨及成脂诱导液的培养基进行诱导.结果与结论:①茜素红染色显示,成骨诱导后细胞存在多个矿化结节,细胞中碱性磷酸酶活性明显增加;②甲苯胺蓝染色显示,成软骨诱导后细胞基质中分泌大量的糖胺聚糖;③油红O染色显示,成脂诱导后,细胞浆内可见脂滴;④实时荧光PCR结果显示,成骨、成软骨及成脂诱导21 d后,相关基因表达较7d时明显增高;⑤结果人羊膜间充质干细胞具有向成骨细胞,软骨细胞及脂肪细胞的潜能,可选作为组织工程学的种子细胞.
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人脐带间充质干细胞的分离鉴定及多向诱导分化
背景：脐带间充质干细胞取材方便、无创，不受伦理学限制，比一般干细胞原始，免疫原性小，其应用前景广阔，是一种理想的种子细胞。
目的：分离鉴定脐带间充质干细胞，并诱导其向成骨细胞和成脂细胞分化。
方法：组织块贴壁法分离纯化脐带间充质干细胞，取对数生长期的第3代细胞，观察细胞形态、生长方式；流式细胞仪检测干细胞表型CD90、CD105、CD34和CD45的表达情况，并在体外检测能否将其诱导分化为成脂细胞及成骨细胞。
结果与结论：用组织块法成功分离培养出脐带间充质干细胞，流式细胞学鉴定显示细胞强表达 CD90和CD105，不表达 CD34和 CD45；能在体外将其成功诱导为脂肪细胞和成骨细胞。结果显示组织块贴壁法能够从人脐带中分离出间充质干细胞，该细胞可向成脂细胞及成骨细胞分化。 -
不同代数人脂肪干细胞分泌多种细胞因子水平的比较
背景:脂肪干细胞可分泌丰富的细胞因子,建立良好的损伤修复微环境,可成为细胞因子治疗各种缺血性疾病的良好的种子细胞来源.目的:观察第2-10代(P2-P10)人脂肪干细胞分泌细胞因子水平的变化情况.方法:从人脂肪组织中分离培养脂肪干细胞,显微镜下观察细胞形态特征,通过细胞免疫表型和细胞体外分化功能对细胞进行鉴定.结果与结论:①细胞形态:脂肪干细胞形态呈长梭形或多角形,胞体丰满、胞浆均匀、核仁清晰,其生长增殖能力较强,体外诱导可进行成脂、成骨和成软骨分化;②流式细胞检测分析结果显示:P3代脂肪干细胞表达间充质表面标志物CD29(99.21%)、CD73(99.65%)和CD90(99.92%),而几乎不表达造血干细胞表面标志CD34(2.25%);③酶联免疫吸附试验结果显示:P5代脂肪干细胞分泌血管内皮细胞生长因子和肝细胞生长因子水平高,P3代脑源性神经营养因子的分泌水平高.结果证实,脂肪组织来源的干细胞生物学特性稳定,表现出良好的生长和增殖潜能;不同代数的脂肪干细胞分泌的血管内皮细胞生长因子、脑源性神经营养因子和肝细胞生长因子浓度不同,P5代脂肪干细胞显示出较强的分泌血管内皮细胞生长因子和肝细胞生长因子的能力,P3代脂肪干细胞显示出较强的分泌脑源性神经营养因子的能力.
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绿色荧光蛋白小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定
目的 探讨体外分离培养绿色荧光蛋白(GFP)小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法,并对GFP-BMSCs进行鉴定.方法 采用贴壁筛选法培养GFP-BMSCs,流式细胞仪检测免疫分型,并用VonKossa试剂盒鉴定细胞的成骨分化能力,油红O染色鉴定细胞的成脂分化能力.结果 分离培养的GFP-BMSCs具有较强的增殖能力和较高的成骨、成脂细胞分化潜能.表型分析显示BMSCs不表达CD34、CD45等造血细胞表面标志,低表达CD106,高表达CD29及CD105等.结论 利用GFP-BMSCs体外培养扩增方法,进而得到一种高表达绿色荧光的BMSCs,成为较为理想、方便、高效的示踪工具,为研究造血干细胞移植的显微解剖关系带来方便.
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皮肤源祖细胞的培养、鉴定和体外诱导分化
目的 探讨皮肤源祖细胞的体外培养、鉴定及定向诱导成脂、成骨的方法,为组织工程提供较理想的种子细胞.方法 出生1～3 d的SD大鼠幼鼠皮肤,以含表皮生长因子和成纤维细胞生长因子的培养基进行培养.观察细胞生长情况,描绘生长曲线;免疫荧光鉴定细胞表达Nestin和Fibronectin情况;将第3代细胞,分别用成脂和成骨诱导液培养14 d,以油红O染色、茜素红染色和免疫荧光检测皮肤源祖细胞诱导成脂、成骨情况.结果 细胞呈悬浮生长,迅速增殖形成克隆球团;细胞免疫荧光表达Nestin和Fibronectin;成脂诱导14 d后,细胞内大量致密颗粒形成,油红O染色可见红色脂滴;成骨诱导14 d后,茜素红染色可见暗红色钙盐沉积,骨桥蛋白表达阳性显示成骨细胞形成.结论 皮肤源祖细胞具有干细胞的特性,能分化为成骨细胞和脂肪细胞.
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体外分离培养人源性脂肪间充质干细胞及其鉴定
目的 体外分离培养人皮下脂肪来源的细胞群,依据国际标准规定通过形态观察、免疫表型检测及多种分化潜能的鉴定证实体外获得的细胞群为脂肪来源的间充质干细胞.方法 采用0.1％胶原酶Ⅰ及0.25％胰酶双消化法进行细胞的体外分离,LG-DMEM培养基加入体积分数为10％胎牛血清,于37℃、5％ CO2的饱和湿度条件下培养,待细胞生长至70％ ～ 80％融合时消化传代扩增.通过倒置显微镜观察细胞形态；流式细胞仪检测细胞免疫表型表达；取第3代细胞,于培养基中分别加入成骨及成脂诱导剂进行定向诱导分化,并对诱导后的细胞染色鉴定.结果 分离培养的细胞群呈长梭状,漩涡样贴壁生长；流式细胞仪检测P2代细胞,其中CD73,CD105,C90,CD44,CD29及CD49d呈阳性表达,而CD14,CD34,CD45,HLA-DR及CD106呈阴性表达；成骨诱导3周后,茜素红染色、VON-KOSSA染色及细胞碱性磷酸酶染色都呈阳性；成脂诱导2周后,细胞内有小脂滴出现,油红O染色呈阳性.结论 胶原酶胰酶双消化法从脂肪组织中分离获得的细胞可贴壁生长；流式细胞仪检测证实细胞表达与间充质干细胞相符的免疫表型；定向诱导后具有成骨及成脂分化能力；符合间充质干细胞的特性.
