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丁酸钠诱导人骨髓增生异常综合征细胞株SKM-1分化作用中细胞外信号调节激酶通路的改变
本研究探讨细胞外信号调节激酶(ERK)通路在丁酸钠(NaB)诱导人骨髓增生异常综合征细胞株SKM-1分化中的作用,阐明丁酸钠诱导SKM-1细胞分化的分子机制.用Western blot方法检测总ERK和磷酸化ERK的表达水平;将ERK特异性的抑制剂PD98059与丁酸钠联合应用,观察它们对SKM-1细胞生长曲线的影响及分化效应,并用Western blot方法检测P21和组蛋白脱乙酰酶(HDAC)蛋白质的表达水平.结果表明:SKM-1细胞经1mmol/L的丁酸钠作用后,总ERK的表达水平未发生变化,而磷酸化ERK的表达水平下降;丁酸钠及丁酸钠+PD98059均可以上调P21和HDAC蛋白质的表达水平,且丁酸钠联合PD98059的作用强于丁酸钠单用.结论:ERK通路抑制是丁酸钠诱导SKM-1细胞分化的重要分子机制.
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丁酸钠联合全反式维甲酸对MDS细胞株SKM-1的诱导分化作用及其机制初步探讨
本研究探讨丁酸钠(NaB)抑制MDS细胞株SKM-1细胞生长、诱导其分化的分子机制,并研究其与全反式维甲酸(ATRA)的协同作用.用台盼蓝拒染实验观察药物对细胞生长曲线的影响;四氮唑盐还原试验和细胞表面分化抗原检测观察药物对细胞的分化作用;流式细胞术分析细胞周期;RT-PCR检察D型细胞周期蛋白、CDK和P21在mRNA水平的表达.结果表明:NaB和(或)ATRA均可抑制SKM-1细胞的生长,诱导细胞分化,将细胞周期阻滞于G0/G1期;ATRA下调CDK6、CDK4、cyclin D3和cyclin D1 mRNA的水平;NaB下调CDK2、cyclin D2和cyclin D1 mRNA的水平;两药联用下调CDK6、CDK4、CDK2、cyclin D1、cychn D2和cyclin D3 mRNA的水平:ATRA和(或)NaB均上调P21 mRNA的水平.结论NaB诱导SKM-1的分化可能是通过上调P21 mRNA的水平和抑制cyclin D-CDK复合体的形成完成的,NaB与ATRA对SKM-1细胞株的分化有协同作用.
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地西他滨联合曲古抑菌素A对MDS细胞株SKM-1作用的体外研究
本研究探讨去甲基化制剂地西他滨(decitabine)和(或)组蛋白去乙酰化酶抑制荆曲古抑菌素A(TSA)对MDS-RAEB细胞株SKM-1的影响及作用机制.用台盼蓝拒染法研究药物对SKM-1细胞生长曲线的影响;用四氮唑蓝还原试验和流式细胞术观察药物对SKM-1细胞分化作用;用Annexin V-FITC标记药物作用后的细胞,了解其早期凋亡的情况;用RT-PCR研究药物作用前后细胞Fas,survivin和P15INK4B基因表达的变化.结果表明:decitabine和(或)TSA对SKM-1细胞生长有抑制作用,能促进SKM-l细胞分化,细胞表面CD14、CD11b表达增加,HLA-DR表达减少;decitabine和(或)TSA处理SKM-1细胞后,SKM-1细胞凋亡增加,细胞Fas和P15INK4B mRNA表达增加,survivin mRNA表达减少.结论:decitabine和TSA均可以促进SKM-1细胞凋亡和分化,可能与Fas、P15INK4B和survivin基因表达有关,二者联用有协同作用.
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地西他滨对MDS细胞株SKM-1的作用研究
目的:探讨去甲基化制剂地西他滨(5-aza-2'-deoxycytidine,Decitabine)对MDS-RAEB(骨髓增生异常综合征-原始细胞增多型)细胞株SKM-1株的影响以及机制.方法:用台酚蓝拒染法研究药物对SKM-1细胞生长曲线的影响,用NBT(硝基四氮唑蓝)还原试验和流式细胞技术研究药物对细胞的分化作用,用AnnexinV-FITC标记了解药物对细胞的早期凋亡作用,用RT-PCR研究药物作用后P15INK4BmRNA表达的变化.结果:地西他滨对SKM-1细胞有生长抑制作用,能促进SKM-1细胞分化和诱导早期凋亡,上调细胞P15INK4BmRNA表达.结论:地西他滨可能通过上调P15INK4BmRNA表达而促进SKM-1株的分化和诱导细胞早期凋亡.
关键词： 地西他滨 骨髓增生异综合征 SKM-1 p15INK4B基因 -
Bmi-1基因及其编码蛋白在SKM-1细胞系中的表达
目的探讨人类Blymphoma Mo-MLV insertion region(Bmi-1)基因及其编码蛋白在骨髓增生异常综合征(myelodysplasia syndrome,MDS)发病中的地位和作用.方法以正常骨髓和白血病细胞系K562为对照,利用半定量RT-PCR和Western Blot研究MDS细胞系SKM-1中Bmi-1基因在mRNA和蛋白水平的改变.结果SKM-1中Bmi-1在mRNA和蛋白水平均较正常组织有明显表达(P<0.05),二者表达水平与K562细胞系无显著差异(P>0.05).结论Bmi-1基因在MDS亚型RAEB细胞系SKM-1中有明显表达,其在RAEB发病中可能具有重要意义.
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益火生髓复方含药血清对骨髓增生异常综合征细胞株SKM-1增殖的影响
目的:观察益火生髓方含药血清对骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)细胞株SKM-1增殖、凋亡的影响.方法:以不同浓度益火生髓方含药血清处理MDS细胞株SKM-1,24、48、72h后,采用CCK-8法检测细胞增殖抑制率、流式细胞术测定细胞周期及凋亡率,Western blotting检测BCL-2 caspase 3、caspase8、CDK2、survivin、E2F1,疫荧光检测NF-kB蛋白表达水平.结果:益火生髓方含药血清能有效抑制SKM-1细胞增殖,呈时间和剂量依赖性.结论:益火生髓方含药血清能明显抑制SKM-1细胞增殖和诱导其凋亡,可能是通过周期阻滞(使细胞周期阻滞于G0/G1期),从而抑制MDS细胞株SKM-1细胞细胞增殖,其抗MDS作用机制可能是通过调控相关凋亡蛋白水平来实现的.
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SPARC基因RNAi慢病毒载体的构建及其在SKM-1细胞中的表达
目的:构建SPARC基因RNAi慢病毒载体获得稳定产毒的细胞,并观察其对人MDS细胞株SKM-1细胞的转染效率及其对SPARC基因的抑制效率.方法:针对已经筛选确定的SPARC基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的OligoDNA,退火形成双链DNA,与经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生GC-shSPARC慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆并进行测序鉴定.用GC-shSPARC、pHelper1.0和pHelper 2.0载体共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度,并将获得的重组慢病毒CC-shSPARC转染SKM-1细胞,通过荧光显微镜检测转染后GFP表达情况,测定转染效率；RT-PCR和Western blot分别验证转染后SKM-1细胞SPARC mRNA及蛋白的表达.结果:经测序证实,构建出了SPARC shRNA的慢病毒载体GC-sh SPARC.包装、浓缩病毒悬液的滴度为1×109 TU/mL.荧光显微镜下能直接观察到转染组细胞的GFP表达,转染效率为70％,RT-PCR、Western blot技术分别检测到GC-shSPARC慢病毒转染SKM-1细胞SPARC mRNA、SPARC蛋白表达水平较空白组明显降低(P＜0.05).结论:成功构建SPARC基因RNAi慢病毒载体,其能高效干扰SKM-1细胞SPARC基因的表达.
