首页 > 文献资料
-
转染hTERT基因对人角膜内皮细胞增殖及功能维持的影响
目的 探索转染人端粒酶催化亚单位(TERT)促进人角膜内皮细胞(HCECs)增殖并进行长期培养的可行性.方法 原代HCECs生长到80％融合时,采用脂质体介导的方法将质粒pEGFP-N1和pBABE-puro-hTERT转染到HCECs,1μg/mL嘌呤霉素筛选.RT-PCR和Western blot检测嘌呤霉素耐药克隆中TERT的表达情况.阳性克隆进行传代培养.MTT法和细胞周期检测比较细胞的生长增殖能力;透射电镜检测细胞的超微结构,RT-PCR检测泵功能相关基因的表达,Western blot检测Na+/K+-ATPase α1的表达,免疫荧光检测ZO-1、N-cadherin的表达.结果 TERT-HCECs表达了外源的TERT已经传到36代,保持了正常的HCECs形态且比HCECs具有更强的增殖能力;泵功能相关基因、Na+/K+ ATPase α1、ZO-1的表达在TERT-HCECs和HCECs中差异无统计学意义.TERT-HCECs能形成单层结构,并保持与原代HCECs细胞相似的泵功能.结论 通过转染TERT,建立了一株与原代生理功能相近且具有更强增殖能力的TERT-HCECs.
-
Pax6基因转染对脂肪来源间充质干细胞的诱导分化研究
目的 探讨应用Pax6基因转染诱导脂肪来源间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADMSCs)分化为角膜上皮样细胞的可行性. 方法 取健康5～6周龄C57BL/6小鼠双侧腹股沟脂肪,分离、培养ADMSCs,取第3代细胞进行基因转染.设未转染组(A组)、pcDNA3.1空质粒组(B组)和pcDNA3.1-Pax6重组质粒组(C组),转染48 h后取B、C组进行G418筛选,倒置显微镜下观察细胞形态学改变;Western blot检测各组Pax6蛋白以及角膜上皮细胞特异性标志分子——细胞角蛋白12 (cytokeratin 12,CK-12)表达;实时荧光定量PCR检测各组CK-12mRNA表达. 结果 A、B组细胞形态无改变;C组筛选出两类不同形状的细胞克隆,一类呈“铺路石”状,形态类似角膜上皮细胞,命名为筛选克隆1;另一类呈网状,有3～7个细胞突起,命名为筛选克隆2.Western blot检测示,A、B组Pax6蛋白表达均为阴性,C组两类细胞克隆均有Pax6蛋白表达;仅C组筛选克隆1CK-12蛋白表达为阳性,其余3组均为阴性.实时荧光定量PCR检测示,C组筛选克隆1的CK-12 mRNA相对表达量为8.64±0.73,高于筛选克隆2(0.55±0.42)、B组(1.36±0.40)和A组(1.00±0.00)(P＜0.05);A、B组以及C组筛选克隆2比较差异均无统计学意义(P＞0.05). 结论 Pax6基因转染能够诱导小鼠ADMSCs分化为角膜上皮样细胞,同时促进CK-12表达,为组织工程角膜构建提供了一种有效的上皮细胞来源.
-
两种生物衍生材料修复兔角膜浅层缺损的初步实验研究
目的比较脱细胞冻干羊膜与脱细胞冻干牛角膜基质在修复兔角膜浅层缺损后的机体反应,以寻找适合的组织工程角膜支架.方法新鲜健康人胎盘羊膜按罗静聪等制备方法处理,冻干后消毒备用.牛角膜经0.25%胰蛋白酶消化,生理盐水漂洗后,冻干,消毒备用.雌性日本大耳白兔20只,随机分为A、B组,每组10只.常规麻醉消毒后,采用7.5 mm直径环钻造出约1/3角膜厚度的缺损.A组采用复水后的脱细胞冻干羊膜修复;B组采用脱细胞冻干牛角膜基质修复.术后裂隙灯显微镜下观察植片和新生血管状况,并于术后2、4、8周取标本,HE染色,组织学观察.结果术后两组植片无溶解、脱落,于8周降解完全,角膜中央缺损区域大部分恢复透明.两组均有新生血管长入角膜,两组新生血管长入范围比较,差异无统计学意义(P>0.05).组织学观察2周时两组均有较重的炎性反应,成纤维细胞增生,胶原排列紊乱;4周时炎性反应均减轻,植片区域可以见到新生血管长入;8周时均有较多的成纤维细胞存在,并有少量瘢痕形成.结论脱细胞冻干羊膜与脱细胞冻干牛角膜基质修复角膜浅层缺损,仍能引起一定程度的排斥反应,需要进一步的改进.
-
组织工程角膜生物材料载体制备的比较性研究
目的比较用不同的方法脱细胞处理异种(猪)角膜基质制备组织工程角膜支架材料,并对其生物相容性进行研究.方法成年York猪角膜基质材料,以Triton联合0.25%胰酶,处理30 min～3 h为材料1;Triton联合DNA-RNA酶,处理8～14 h为材料2;Triton联合0.25%胰酶、DNA-RNA酶,处理3～5 h为材料3.3种材料用无水氯化钙脱水干燥保存.在材料上接种兔角膜基质成纤维细胞,观察细胞生长情况.新西兰大白兔24只,随机分为3组,每组8只.右眼为实验眼,左眼为空白对照眼.将材料植入兔眼角膜基质层中,术后每日裂隙灯检查术眼;1、4、8和12周分别随机取2只兔眼角膜作HE染色,观察材料的生物相容性.结果材料1、2细胞脱出不完全,处理佳时间分别是2 h和10～12 h,角膜基质网状间隙无明显增大;接种兔角膜基质成纤维细胞后,3～4 d细胞死亡;植入兔角膜基质中有明显的免疫排斥反应.材料3脱出细胞完全,其脱细胞处理的佳时间为4 h,角膜基质纤维结构无破坏,呈三维网状结构,网状间隙明显增大;接种兔角膜基质成纤维细胞后,细胞在材料上贴附生长良好;将其植入兔角膜基质中无炎性及排斥反应,可逐渐降解吸收,有良好的生物相容性.结论 Triton联合0.25%胰酶、DNA-RNA酶法处理的异种(猪)角膜基质具有良好的生物相容性,可作为一种组织工程角膜的支架材料.
-
角膜组织工程的研究进展
目的介绍并综合分析角膜组织工程的研究进展.方法通过广泛查阅近期相关文献,重点介绍组织工程角膜种子细胞的来源、选择,以及体外培养中各种生长因子对角膜细胞生长繁殖的影响;支架材料的选择和制备及各自的优缺点.结果组织工程角膜种子细胞的来源为人眼的正常角膜细胞,以胎儿角膜为佳;各种生长因子对角膜细胞的培养、生长繁殖,以及与细胞外和细胞间基质的结合有明显促进作用,其中以成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、角膜细胞生长因子(keratinocyte growth factor, KGF)、转化生长因子(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)影响明显.支架材料可选择动物胶原+壳聚糖、以及黏多糖等,各有其优缺点.结论组织工程角膜可以构建和移植,与受体组织相容性较好,有望成为人体角膜移植的等效物.
-
复合自体脂肪干细胞的脱细胞猪角膜基质移植治疗兔角膜碱烧伤
目的:研究复合脂肪干细胞的脱细胞猪角膜基质对碱烧伤角膜的治疗效果.方法:制备晾干的脱细胞猪角膜基质,取第3代体外培养的兔自体脂肪干细胞,体外种植到脱细胞猪角膜基质上,培养3d后用于板层角膜移植.结果:板层角膜移植2mo后,术眼角膜基本恢复透明,未发生排斥反应,新生血管较少,3mo后新生血管基本消退.结论:复合自体脂肪干细胞的脱细胞猪角膜基质对兔碱烧伤角膜具有良好的修复能力.
