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转染hTERT基因对人角膜内皮细胞增殖及功能维持的影响
目的 探索转染人端粒酶催化亚单位(TERT)促进人角膜内皮细胞(HCECs)增殖并进行长期培养的可行性.方法 原代HCECs生长到80％融合时,采用脂质体介导的方法将质粒pEGFP-N1和pBABE-puro-hTERT转染到HCECs,1μg/mL嘌呤霉素筛选.RT-PCR和Western blot检测嘌呤霉素耐药克隆中TERT的表达情况.阳性克隆进行传代培养.MTT法和细胞周期检测比较细胞的生长增殖能力;透射电镜检测细胞的超微结构,RT-PCR检测泵功能相关基因的表达,Western blot检测Na+/K+-ATPase α1的表达,免疫荧光检测ZO-1、N-cadherin的表达.结果 TERT-HCECs表达了外源的TERT已经传到36代,保持了正常的HCECs形态且比HCECs具有更强的增殖能力;泵功能相关基因、Na+/K+ ATPase α1、ZO-1的表达在TERT-HCECs和HCECs中差异无统计学意义.TERT-HCECs能形成单层结构,并保持与原代HCECs细胞相似的泵功能.结论 通过转染TERT,建立了一株与原代生理功能相近且具有更强增殖能力的TERT-HCECs.
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应用羊膜上皮干细胞微环境培养人角膜内皮细胞的研究
目的:建立一种利用羊膜上皮干细胞(human amniotic membrane epithelial cell,HAEC)微环境培养人角膜内皮细胞(human corneal endothelial cells,HCEC)的方法.方法:制备羊膜上皮干细胞微环境培养HCEC,并探讨诱导HCEC增殖的佳培养微环境,倒置相差显微镜和透射电镜观察培养过程中细胞的形态学变化,MTT和Giemsa染色观察细胞增殖情况,Hoechst33342检测凋亡细胞比例.结果:在HCEC基本培养液(corneal endothelial cell medium,CEM)的基础上添加20％ HAEC上清、HAEC-HCEC的微环境可促进HCEC的增殖,减少凋亡,细胞传代能力显著增强,HAEC-HCEC组传至4代仍保持多角形的内皮细胞形态.结论:羊膜上皮干细胞微环境培养可有效提高HCEE的增殖能力,更好地维持HCEC的形态,并能抑制其凋亡进程.
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人角膜内皮细胞的体外培养及其鉴定的研究进展
角膜内皮细胞对维持角膜的透明性和厚度起着关键性的作用。人体内角膜内皮细胞有限的增殖能力及角膜供体的短缺，使组织工程人角膜内皮的体外重建受到了关注。目前，人角膜内皮细胞的培养方法已基本成熟。但是体外培养的人角膜内皮细胞的功能评价及鉴定标准却尚未建立。本文就人角膜内皮细胞的体外培养及其鉴定的研究进展进行综述。
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噻吗心安对人角膜内皮细胞的影响作用研究
目的:揭示抗青光眼药物噻吗心安(timolol maleate)对体外培养人角膜内皮(HCE)细胞的影响作用,为其眼科临床安全用药提供实验依据.方法:用不同浓度噻吗心安处理体外培养的HCE细胞,在倒置显微镜下观察细胞的生长、增殖和形态变化,利用吖啶橙/溴化乙锭荧光双染色法检测质膜的通透性,利用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA的断片化,利用透射电镜观察细胞的超微结构.结果:噻吗心安在0.15625~5g/L的浓度范围内均能不同程度地引起HCE细胞出现不同程度的生长缓慢、数量减少、胞质皱缩、胞内空泡化、变圆脱落、质膜通透性增大、染色质凝缩、DNA断片化和出现凋亡小体等典型的细胞凋亡特征,并具有浓度和时间依赖性.临床使用浓度2.5~5g/L的噻吗心安对HCE细胞的凋亡诱导作用大,处理28h的凋亡率高达83.23%~96.71%.结论:噻吗心安在0.15625~5g/L的浓度范围内能显著诱导HCE细胞凋亡,临床使用浓度时对HCE细胞的毒性作用极大,在眼科临床中应谨慎使用.
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盐酸奥布卡因对人角膜内皮细胞影响作用的实验研究
目的:揭示眼科局部麻醉剂盐酸奥布卡因(oxybuprocaine hydrochloride,OBPC-HCl)对体外培养人角膜内皮(HCE)细胞的影响作用,为眼科临床安全用药提供实验依据.方法:用不同浓度OBPC-HCl处理体外培养的HCE细胞,在倒置显微镜下观察细胞的生长和形态变化,用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)荧光双染色法检测质膜的通透性,用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA的断片化,用透射电镜检测细胞的超微结构.结果:OBPC-HCl在62.5mg/L～4g/L的浓度范围内均能不同程度地引起HCE细胞出现细胞皱缩、胞内空泡化、质膜通透性增大、染色质凝缩、凋亡小体和DNA断片化等典型的细胞凋亡特征,并具有浓度和时间依赖性,临床使用浓度4g/L OBPC-HCl对HCE细胞的凋亡诱导作用大,处理1h后HCE细胞的凋亡率已高达100%.结论:OBPC-HCl在62.5mg/L～4g/L的浓度范围内能显著诱导HCE细胞凋亡,在眼科临床应用中对HCE细胞的毒副作用极大.
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转化生长因子-β2体外抑制人角膜内皮细胞增殖的作用
目的:研究转化生长因子TGF-β2对体外培养人角膜内皮细胞(HCEC)增殖的影响机制.方法:体外培养经血清饥饿法获得同步化的HCEC,用不同浓度TGF-β2对HCEC进行不同时间的处理,采用细胞计数、MTT染色以及流式细胞仪(FCM)和Realtime PCR检测TGF-β2对HCEC的增殖、细胞周期及细胞中p27kip1和p21cip1表达的影响.结果:TGF-β2 1～15μg/L对HCEC有显著的增殖抑制作用,具有浓度和时间依赖性,9μg/L是TGF-β2抑制HCEC细胞增殖的峰浓度.9μg/L TGF-β2处理后,处于G1/G0期HCEC数量显著增加,并具有时间依赖性.9μg/L TGF-β2处理24h后, p27kip1表达量显著增加,48h后p27kip1和p21cip1的表达量均显著增加,也具有时间依赖性.结论:TGF-β2对HCEC具有显著的浓度和时间依赖性增殖抑制作用,可能通过先后诱导p27kip1和p21cip1表达量的增加将细胞拘留在G1/G0期来实现的.
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组织工程人角膜内皮的体外重建及其形态结构
目的:组织工程人角膜内皮(tissue-engineered human corneal endothelia,TE-HCE)的体外重建及其形态结构.方法:用有限稀释法从HCE细胞系筛选出单克隆细胞(mcHCE细胞),用常规染色体标本制作和核型分类学方法进行核型分析.用羊膜的胰酶倒置消化和细胞外基质蛋白包被方法制备去上皮层修饰羊膜(mdAM).以核型正常的对数期mcHCE细胞为种子细胞,以平铺于24孔培养板孔底的mdAM为载体支架,用200mL/L胎牛血清-DMEM/F12培养液在37℃,50mL/L CO2培养箱中进行TE-HCE的体外重建.用茜素红染色、冰冻切片HE染色、倒置显微镜和扫描电镜观察种子细胞的形态、细胞连接的形成情况、细胞单层的完整性及其与mdAM结合的紧密程度.用透射电镜方法鉴定种子细胞的超微结构以及细胞连接的形成情况.用免疫荧光技术检测种子细胞对不同细胞连接蛋白的表达模式.结果:从非转染HCE细胞系中筛选出了7个核型正常(2n=46)的单克隆细胞株.在启动重建30h后,mcHCE种子细胞在mdAM上形成了完整的细胞单层,细胞密度高达3 413/mm2.HCE细胞呈多角形细胞形态,形成了完整的细胞单层,且在细胞-细胞以及细胞-mdAM间形成了多种细胞连接,种子细胞在超微结构上与在体HCE细胞类似,胞质中含有许多线粒体,并具有紧密连接蛋白-1、钙黏蛋白、间隙连接蛋白-43和整联蛋白αv/β5的阳性表达.结论:体外重建的TE-HCE在结构和功能上与在体HCE相似,有望作为HCE的替代物用于临床角膜内皮移植.
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体外重建组织工程人角膜内皮在新西兰兔角膜内皮移植中的应用
目的:验证体外重建组织工程人角膜内皮(TE-HCE)在角膜内皮移植中的作用.方法:以非转染人角膜内皮细胞(HCE细胞)为种子细胞,以去上皮层修饰羊膜为载体支架体外重建的TE-HCE,经CM-DiI标记后对撕除内皮层和后弹力层(DM)的新西兰兔进行了兔穿透性角膜内皮移植.用裂隙灯显微镜观察移植眼角膜的透明度.用荧光显微镜观察种子细胞荧光标记.用茜素红染色和冰冻切片HE染色和扫描电镜观察种子细胞的形态、细胞连接的形成情况、细胞单层的完整性及其与DM结合的紧密程度.用透射电镜方法鉴定种子细胞、DM和角膜的超微结构.结果:TE-HCE可使新西兰兔角膜保持透明39d以上.角膜内皮层移植区的细胞均带有CM-DiI荧光标记.绝大多数种子细胞为六角形,细胞间连接紧密,重建出了完整的角膜内皮层,且内皮层与DM结合紧密.种子细胞重建出了连续的角膜内皮层,种子细胞、DM和角膜的形态结构与正常对照眼的几乎相同.结论:移植后的TE-HCE在种子细胞形态、连续单层状态、细胞连接形成及超微结构上均与对照兔眼的角膜内皮类似,使移植新西兰兔角膜长期保持透明.
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人角膜内皮细胞体外氧化损伤及黄酮抗氧化保护作用的机制
目的:揭示黄酮对人角膜内皮细胞(human corneal endothe-lial cells,HCEC)的抗氧化保护作用及其机制.方法:利用HCEC的体外培养体系,采用形态观察,吖啶橙/溴化乙锭荧光双染色和DNA琼脂糖凝胶电泳等技术手段研究了黄酮和/或过氧化氢(H2O2)处理对HCEC细胞凋亡的影响,使用酶联免疫吸附试验分别对70μmol/L黄酮和/或600μmol/L H2O2处理不同时间后HCEC中凋亡诱导因子(AIF)与细胞色素C(CytC)的浓度变化进行了检测.结果:在600μmol/L H2O2处理8h,细胞凋亡率约为60%的HCEC氧化损伤模型中,70μmol/L黄酮预处理30min可使HCEC的细胞凋亡率降至约8%,而仅用黄酮处理组HCEC的细胞凋亡率约为1%.HCEC的总CytC浓度于H2O2处理3h后达到峰值(约为对照组的7.97倍),总AIF浓度于处理6h后达到峰值(约为对照组的1.28倍),而黄酮预处理组和仅用黄酮处理组HCEC的总CytC和AIF浓度与阴性对照组没有显著差异.结论:H2O2诱发HCEC凋亡是促使线粒体中CytC和AIF的外流引起的;70μmol/L黄酮对600μmol/L H2O2所致HCEC细胞凋亡具有很强的抗氧化保护作用.
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黄酮对体外培养人角膜内皮细胞的影响及其抗氧化作用
目的:确定黄酮对人角膜内皮细胞(human corneal endothe-lial ceils,HCEC)的影响及其对因氧化损伤所致细胞凋亡的抗氧化保护作用.方法:利用体外培养的HCEC,通过添加不同浓度的黄酮继续培养,或经不同浓度黄酮预处理后再添加过氧化氢(H2O2)继续培养,采用光镜形态观察、吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双染色和DNA琼脂糖凝胶电泳等技术手段,研究黄酮对HCEC的影响及其抗氧化作用.结果:黄酮浓度高于85μmol/L时可诱导HCEC发生细胞凋亡,而低于70μmol/L时对HCEC没有影响;55和70μmol/L黄酮预处理对600μmol/L H2O2所引起的HCEC细胞凋亡具有显著的抑制作用(60%→22%,8%;P<0.01),而85和100μmol/L黄酮预处理对H2O2所引起的HCEC细胞凋亡没有显著的抑制作用.结论:55～70μmol/L黄酮对HCEC具有显著的抗氧化保护作用,而浓度高于85μmol/L的黄酮反而能诱发HCEC发生细胞凋亡.
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人角膜内皮细胞的分离、培养及鉴定
人角膜内皮细胞(HCECs)位于角膜内侧,增殖能力有限,损伤后容易失去代偿功能,发生内皮盲.目前,角膜移植是治疗该疾病的唯一有效的方法,但供体短缺等因素制约了角膜移植术的应用.因此,使用组织工程角膜作为传统角膜供体的替代物已迫在眉睫.本文回顾了近年来国内外相关研究成果,阐述了为克服接触性抑制和内皮-间质转化(EMT)的问题,学者们对HCECs的分离和体外培养方法进行改进,并总结了从形态学,关键标志物以及基因水平来鉴定HCECs的方法,为HCECs组织工程角膜内皮植片的进一步研究提供参考.
