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miR-140 tough decoy文献资料
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抑制miR-140腺相关病毒载体的构建及鉴定
目的 构建一种抑制microRNA-140(miR-140)表达的腺相关病毒(AAV)载体系统,从而实现对细胞内miR-140表达水平的高效抑制.方法 应用分子生物学方法将腺相关病毒载体与miRNA诱饵microRNA tough decoy RNAs (TuD)相结合,构建pAAV-U6-miR-140-TuD-EGFP表达质粒;用脂质体转染法将pAAV-U6-miR-140-TuD-EGFP表达质粒和pAAV-RC、pAAV-Helper质粒共转染至AAV-293细胞中,包装生成携带miR-140-TuD的重组腺相关病毒rAAV-U6-miR-140-TuD-EGFP.进一步将病毒感染骨肉瘤细胞U2OS,定量RT-PCR检测miR-140-TuD对细胞内miR-140基因的沉默效果,并测定病毒的感染滴度.结果 DNA测序证明miR-140-TuD已成功构建到表达质粒pAAV-U6-MCS-EGFP中;AAV-293细胞表达绿色荧光蛋白提示共转染成功;rAAV-U6-miR-140-TuD-EGFP感染滴度约为4.1 ×1010· mL-1;包装的重组腺相关病毒rAAV-U6-miR-140-TuD-EGFP感染U2OS细胞后,能显著下调U2OS细胞miR-140基因的表达水平.结论 携带miR-140-TuD重组腺相关病毒的包装成功,该病毒具有稳定沉默miR-140基因从而降低其表达水平的功能.
