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抑制cyclinD1表达对乳腺癌细胞增殖及cyclinE、CDK2和p21cip1转录的影响
目的分析探讨人乳腺癌细胞中cyclinD1的表达受到反义RNA抑制后,细胞增殖能力的变化以及cyclinE,CDK2和p21cip1(cip1/waf1/sdi1)基因表达受到的影响. 方法将表达cyclinD1反义RNA的重组质粒转入人乳腺癌细胞,由此抑制细胞中cyclinD1的表达,然后分析细胞生长速率和各时相细胞分布比例的变化,并通过Northern blot分析有关基因的表达水平. 结果 cyclinD1表达受到抑制的细胞与对照相比,细胞增殖速率明显下降,培养至第6d时,生长抑制率为54%.细胞周期各时相的分布比例也有较大的变化,G1期细胞比例上升,而S期及G2/M期细胞比例下降.cyclinE和CDK2的mRNA水平显示出有不同程度的下降,而p21cip1的表达无明显变化. 结论 cyclinD1表达的抑制可明显减弱人乳腺癌细胞的异常增殖,同时表明同为细胞周期调控基因的cyclinE和CDK2的表达与cyclinD1的表达密切相关,而p21cip1的表达不受cyclinD1的影响.
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大肠癌胃泌素、生长抑素的表达及比势与细胞周期调控基因的相关性
目的:探讨大肠癌组织中胃泌素(GAS)、生长抑素(SS)的表达及其比势与细胞周期调控蛋白P16INK4a、P21CIP1及细胞周期素(Cyclins)、细胞周期依赖性蛋白激酶(CDKs)表达的关系.方法:随机选择79例大肠癌患者的手术切除标本,采用免疫组化SP法检测GAS、SS、P16INK4a、P21CIP1、Cyclin D1、Cyclin E、Cyclin A、Cyclin B1、CDK2、CDK4的表达情况.结果:Cyclin D1、CDK2、CDK4、Cyclin A在GAS高表达组、中表达组的阳性表达率明显高于低表达组;而P16INK4a、P21CIP1阳性表达率与此相反.Cyclin E在SS低表达组的阳性表达率明显高于中表达组、高表达组;P21CIP1在SS高表达组、中表达组的阳性表达率明显高于低表达组;CDK2在SS低表达组的阳性表达率明显高于SS高表达组.大肠癌组织中GAS、SS表达的积分比值(GAS/SS)与Cyclin D1(r=0.252)、Cyclin E(r=0.387)、Cyclin A(r=0.466)、CDK2(r=0.519)、CDK4(r=0.434)呈正相关(P＜0.01)与P16INK4a(r=-0.385)、P21CIP1(r=-0.454)蛋白的表达积分呈负相关(P＜0.01).结论:GAS、SS对大肠癌细胞生长的调控可能与P16INK4a、P21CIP1、Cyclin Dl、CyclinA、CDK2、CDK4、Cyclin E基因异常表达有关.GAS对大肠癌细胞周期的调控位点可能在Gl、S、G2期,SS对大肠癌细胞周期的调控位点可能在G1/S、G2/M期的交界点,即S、M期的入口.对大肠癌GAS/SS积分比值分析,可作为临床大肠癌生物学行为的重要评估指标.
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凝血酶诱发人支气管上皮细胞恶性转化
目的探讨凝血酶对人类支气管上皮细胞的致癌性和转化涉及的相关机制.方法用75 nmol·L-1凝血酶持续刺激人类乳头状瘤-18永生化的人支气管上皮细胞(BEP2D)70 d,观察不同代龄细胞的血清抗性、软琼脂克隆形成率,流式细胞术观察细胞周期改变,逆转录-聚合酶链反应检测凝血酶受体-蛋白酶活化受体(PAR1),c-myc和p21cip1基因表达水平,蛋白质免疫印迹检测C-MYC和P21cip1蛋白表达变化,鉴定细胞的恶性转化表型.结果经传代培养,凝血酶处理的第10代BEP2D细胞血清抗性增强,接种效率提高,第20代细胞呈非贴壁依赖性生长,软琼脂克隆形成率升高达(0.461±0.009)%.流式细胞术结果显示,第22代细胞处于S期比例为55.63%.凝血酶转化第25代、第27代细胞PAR1基因、c-myc基因及C-MYC蛋白表达水平上调.相反,p21cip1基因和P21cip1蛋白表达减弱.凝血酶处理的第20代细胞已具有较为稳定的转化表型和细胞生物学特性,可能是具有裸小鼠致瘤型的恶性转化细胞.每升2×104 抗凝血酶单位水蛭素能够拮抗凝血酶对BEP2D细胞的恶性转化作用.结论凝血酶对人支气管上皮细胞具有恶性转化作用,c-myc基因转录和蛋白表达活化与p21cip1失活在这一过程中发挥关键作用.
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Ang Ⅱ诱导血管内皮细胞衰老相关基因表达的研究
目的 探讨血管紧张索Ⅱ(AngⅡ)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)衰老相关基因p16INK4a、p21cip1的表达.方法 体外培养HU-VECs并予AngⅡ(10-6mol/L)干预,采用光镜观察细胞形态学改变,β-半乳糖苷酶(β-gal)染色和流式细胞术鉴定细胞衰老,并利用免疫细胞化学染色法分析Ang Ⅱ诱导HUVECs 0、12、24、36、48 h的p16INK4a阳性细胞表达率,Western印迹法分析AngⅡ诱导HUVECs 0、12、24、36、48 h的p16INK4a、p21cip1蛋白表达的时间效应关系.结果 AngⅡ诱导组HUVECs出现典型的细胞体积增大,形态不规则;约80%的细胞呈现β-gal阳性染色(80.10±6.81)%,流式细胞仪检测细胞周期停滞于G0/G1(91.36±6.45)%,证实细胞衰老;AngⅡ呈时间依赖性上调p16IK4a、p21cip1蛋白表达.结论 AngⅡ诱导血管内皮细胞衰老的分子机制之一可能与上调衰老细胞内细胞周期蛋白p16INK4a、p21cip1的表达,使细胞周期停滞于G1期有关.
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骨髓增生异常综合征细胞周期相关分子表达的初步研究
目的:研究骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)患者细胞周期负性调控因子(p21cip1、p27kip1、p57kip2)的表达水平及细胞周期改变.方法:采用流式细胞仪检测MDS患者骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cell,BMNCs)细胞周期情况,应用实时荧光定量PCR检测其p21cip1、p27kip1、p57kip2 mRNA表达水平.结果:高危MDS组及MDS-AML组(包括10例MDS转白血病患者及8例AML患者)的p21cip1表达水平显著低于正常对照组(P值分别为0.008、0.029),而低危MDS组与正常对照组差异无统计学意义；p27kip1表达水平在各组间差异无统计学意义；低危MDS组、高危MDS组及MDS-AML组p57kip2表达均显著低于正常对照组(P＜0.001)；高危MDS组及MDS-AML组的S期细胞比例显著高于正常对照组(P＜0.05).G0/G1期及G2/M期细胞比例则在各组间差异无统计学意义,而高危MDS组、MDS-AML组的S期细胞比例显著高于正常对照组.结论:MDS患者BMNCs存在细胞周期负性调控基因表达的异常,与细胞周期的改变相关.
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CyclinD1和p21CIP1在大鼠肺发育过程中的动态表达
目的 细胞周期素D1(CyclinD1)、p21CIP1是主要的肺细胞增殖调控蛋白,参与肺发育、肺损伤修复过程.本研究观察大鼠肺发育过程中小管期、囊泡期、肺泡期等不同阶段CyclinD1和p21CIP1的表达特征.方法 分别于孕20 d、21 d、生后0 d、3 d,7 d、14 d、21 d取胎鼠或新生鼠肺组织标本(n=6),用免疫组织化学技术检测CyclinD1和p21CIP1在大鼠肺发育各期定位表达,免疫印迹半定量检测大鼠肺发育过程中CyclinD1和p21CIP1蛋白的表达.结果 在大鼠肺发育各期中,小管期CyclinD1蛋白表达强,肺泡期CyclinD1蛋白表达弱.而p21CIP1蛋白表达在小管期弱,肺泡期强.在小管期CyclinD1阳性表达主要定位于上皮细胞,p21CIP1表达阴性.囊泡期CyclinD1表达强度明显减弱,CyclinD1和p21CIP1阳性表达主要定位于上皮细胞和间质细胞.肺泡期p21CIP1表达强,CyclinD1阳性表达主要定位于间质细胞,p21CIP1阳性表达主要定位于上皮细胞.结论 大鼠肺发育过程中CyclinD1和p21CIP1在各期表达部位及数量有差异,在小管期,CyclinD1表达强,细胞增殖活动明显较囊泡期和肺泡期旺盛,肺泡期p21CIP1表达强与肺泡分隔及成熟有关.
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应用纳米技术研究p21cip1基因对人RPE增殖的抑制作用
目的:通过新兴的纳米粒子基因载体观察p21cip1基因对视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞增殖的抑制情况.方法:制备p21cip1基因纳米粒子,将其转染到培养的人RPE细胞,通过免疫组织化学检测p21cip1蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞周期的相关细胞量的变化.结果:p21cip1纳米粒子的DNA含量为3%,包封效率为78%,p21cip1基因在体内由于PLGA-PVA载体的保护作用,可以维持比质粒更长时间的有效期,减少质粒易被生物体内核酸酶降解的问题.流式细胞仪检测显示转染了目的基因的RPE细胞发生G1期阻滞,细胞增殖明显受到抑制.免疫组织化学检测结果显示转染了目的基因的RPE细胞p21cip1蛋白表达明显增强.结论:p21cip1基因有可能作为一个目的基因,借助新兴的基因载体纳米粒子用于抑制细胞增殖的基因治疗.
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转化生长因子-β2体外抑制人角膜内皮细胞增殖的作用
目的:研究转化生长因子TGF-β2对体外培养人角膜内皮细胞(HCEC)增殖的影响机制.方法:体外培养经血清饥饿法获得同步化的HCEC,用不同浓度TGF-β2对HCEC进行不同时间的处理,采用细胞计数、MTT染色以及流式细胞仪(FCM)和Realtime PCR检测TGF-β2对HCEC的增殖、细胞周期及细胞中p27kip1和p21cip1表达的影响.结果:TGF-β2 1～15μg/L对HCEC有显著的增殖抑制作用,具有浓度和时间依赖性,9μg/L是TGF-β2抑制HCEC细胞增殖的峰浓度.9μg/L TGF-β2处理后,处于G1/G0期HCEC数量显著增加,并具有时间依赖性.9μg/L TGF-β2处理24h后, p27kip1表达量显著增加,48h后p27kip1和p21cip1的表达量均显著增加,也具有时间依赖性.结论:TGF-β2对HCEC具有显著的浓度和时间依赖性增殖抑制作用,可能通过先后诱导p27kip1和p21cip1表达量的增加将细胞拘留在G1/G0期来实现的.
