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纳米PLLA有序膜制备及其对内皮生长晕细胞的促进作用
通过观察内皮生长晕细胞(EOCs)在纳米PLLA有序膜表面黏附、增殖的情况,为优化组织工程材料提供一种新途径.通过静电纺丝技术制备的纳米PLLA纤维支架,进行低温等离子体技术改性及Ⅰ型胶原表面涂覆,与EOCs复合培养.采用细胞生长曲线和光镜、荧光显微镜及扫描电镜观察支架材料对种子细胞黏附、增殖、形态特征等方面的影响.结果显示:制得的纳米PLLA纤维孔径为300～400 nm,孔隙率>90%;有序膜和超级有序膜组吸光度A值与无序膜、单纯细胞组有显著性差异(P<0.05);细胞在支架膜上生长良好,纳米无序膜细胞生长较散在、杂乱;有良好空间定向效果的有序纤维及超级有序纤维支架有利于细胞沿纤维定向附着、伸展、增殖,分泌胞外基质,而超级有序膜更有利于保持其结构.内皮生长晕细胞是理想的血管组织工程种子细胞来源;纳米PLLA有序及超级有序膜支架能促进种子细胞在材料表面的黏附、增殖,并能较好地保持细胞的形态,是一种理想的血管组织工程支架材料.
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理阿诺碱增强雷帕霉素诱导的内皮生长晕细胞功能并降低内皮型一氧化氮合酶( Thr495)的磷酸化水平
目的 探讨理阿诺碱（ryanodine）对雷帕霉素（rapamycin）诱导的内皮生长晕细胞（endothelial outgrowth cell,EOC）功能及其相关总内皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表达及eNOS( Thr495)的磷酸化水平。方法 密度梯度离心法分离脐血单个核细胞，培养并扩增EOC，免疫组化法、荧光染色法鉴定其内皮细胞特性。实验分为对照组、10 nmol/L rapamycin组（rapamycin组）、10μmol/L ryanodine预处理1h再加10 nmol/L的rapamycin组（ryanodine+ rapamycin组）、10 μmol/Lryanodine组（ryanodine组），各处理组与EOC作用24h，CCK8检测细胞增殖能力，Transwell小室检测细胞迁移能力。用特异性的总eNOS抗体及磷酸化的eNOS( Thr495)[p-eNOS（Thr495）]抗体的蛋白免疫印迹法( Western blot)检测总eNOS蛋白表达及eNOS( Thr495)磷酸化水平。结果 rapamycin组EOC的增殖及迁移均低于对照组（P均＜0.05），eNOS( Thr495)磷酸化水平高于对照组(P＜0.05)，总eNOS蛋白表达与对照组比较差异无统计学意义。Ryanodine+ rapamycin组EOC的增殖及迁移均高于rapamycin组（P均＜0.05），eNOS( Thr495)磷酸化水平低于rapamycin组(P＜0.05)，总eNOS蛋白表达与对照组比较差异无统计学意义。Ryanodine组EOC的增殖、迁移及总eNOS及eNOS( Thr495)磷酸化水平与对照组比较差异均无统计学意义。结论 rapamycin可抑制EOC的增殖及迁移，增强eNOS(Thr495)磷酸化水平。Ryanodine可以改善rapamycin诱导的EOC增殖及迁移能力的抑制，降低eNOS(Thr495)磷酸化水平。
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ADMA对内皮生长晕细胞凋亡及JNK表达的影响
目的 探讨非对称二甲基精氨酸(ADMA)对内皮生长晕细胞(EOCs)凋亡的影响及凋亡相关c-Jun氨基末端激酶(JNK)表达水平的变化.方法 从脐带血中分离培养EOCs并进行鉴定,与不同浓度ADMA(0、1、5、10、20μmol/L)共同培育48 h.在10μmol/L ADMA培养液中加入不同浓度(0、5、10、20、40μmol/L)JNK特异性抑制剂SP600125,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot检测Caspase-3及磷酸化JNK(p-JNK)水平.结果 1、5、10、20μmol/L ADMA可诱导EOCs凋亡,浓度越高凋亡率越高(F=5.681,P<0.05).ADMA还可提高凋亡因子Caspase-3的水平(F=6.733,P<0.05),诱导JNK磷酸化.SP600125可缓解ADMA造成的EOCs细胞凋亡,抑制Caspase-3及p-JNK的表达.结论 ADMA可诱导EOCs细胞凋亡,此作用可能通过激活JNK信号转导途径实现.
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VEGF经PI3K-Akt-Bad通路降低冻存后EOCs凋亡率
目的：探讨血管内皮生长因子（VEGF）对低温冻存内皮生长晕细胞（EOCs）凋亡率的影响及其与PI3K-Akt-Bad信号通路的关系，研究VEGF降低低温冻存EOCs凋亡率的可能机制。方法：采用密度梯度离心法分离人脐带血中的单个核细胞，经体外扩增培养EOCs，用免疫细胞化学染色及荧光染色法鉴定细胞的内皮特性。以扩增后的第二代细胞为生物材料，将其分为W组（wortmannin干预24 h后冻存）、W+V组（wortmannin 干预24 h后+50μg/L VEGF冻存）、BC组（空白对照组）、V组（50μg/L VEGF冻存），于-80℃冻存24 h后复苏。用流式细胞术检测EOCs凋亡率，Western blot法检测p-Akt、Bad、Caspase 3的表达量。结果：采用体外扩增培养的EOCs具有多种内皮细胞特性。低温冻存会增加EOCs的凋亡率（为5.36%±0.27%），但50μg/L VEGF能够降低低温冻存和复苏过程EOCs的凋亡率（为3.36%±0.27%，P＜0.05）；经wortmannin对PI3K特异性抑制后，VEGF对EOCs的保护作用减弱，细胞的凋亡率增加（为8.34%±0.57%，P＜0.05）；加50μg/L VEGF的EOCs冻存细胞p-Akt表达升高而Bad和Caspase 3表达降低（均P＜0.05），经wortmannin干预24 h后的EOCs冻存细胞p-Akt表达降低而Bad和Caspase 3表达升高（均P＜0.05）。结论：50μg/L VEGF能够降低低温冻存EOCs的凋亡率，其作用可能通过PI3K-Akt-Bad信号通路来实现。
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川芎嗪对冻存内皮生长晕细胞的影响
目的:研究川芎嗪(TMP)对冻存复苏后内皮生长晕细胞(EOC)复苏率及其增殖、黏附、成血管能力的影响.方法:密度梯度离心法分离脐带血中单个核细胞,体外扩增培养EOC,免疫组化法、荧光染色法鉴定内皮细胞特性.采用不含TMP(对照组),和含10、25、50 ng/mL TMP的冻存液对EOC进行冻存,24 h后复苏并观察各组细胞在不同时间点的复苏率及增殖、黏附、成血管能力.结果:TMP 10 ng/mL组细胞与对照组细胞间复苏率、增殖、黏附及成血管能力差异无统计学意义,而25 ng/mL及50 ng/mL组的复苏率、增殖、黏附及成血管能力均高于对照组,差异有统计学意义(P＜ 0.05),与正常的未冻存组细胞接近.结论:TMP可以提高冻存后EOC的复苏率,并一定程度地保护复苏后细胞的增殖、黏附及成血管能力.
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理阿诺碱对雷帕霉素诱导的内皮生长晕细胞功能抑制的保护作用
目的 探讨理阿诺碱对雷帕霉素诱导的内皮生长晕细胞(EOCs)功能抑制的影响.方法 密度梯度离心法分离脐血单个核细胞,培养并扩增EOCs,免疫组化法、荧光染色法鉴定其内皮细胞特性.分别加雷帕霉素、理阿诺碱、理阿诺碱预处理1h再加雷帕霉素,与EOCs作用24h,CCK8检测细胞增殖能力,Transwell小室检测细胞迁移能力,并在倒置显微镜下检测细胞的黏附能力.结果 雷帕霉素抑制EOCs的增殖、迁移、黏附能力(P＜0.05).理阿诺碱预处理1h能改善雷帕霉素对EOCs的增殖、迁移、黏附的抑制作用(P＜0.05),理阿诺碱单独作用对EOCs的增殖、迁移、黏附无影响(P ＞0.05).结论 雷帕霉素抑制EOCs的增殖、迁移、黏附能力; 理阿诺碱可以改善雷帕霉素诱导的对体外培养的EOCs增殖、迁移、黏附的抑制作用.
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非对称性二甲基精氨酸对内皮生长晕细胞生物学功能的影响
目的 观察非对称性二甲基精氨酸(ADMA)对内皮生长晕细胞(EOC)及其生物学功能的影响.方法 分离脐血中单个核细胞,采用贴壁培养法培养EOC,以免疫细胞化学染色及荧光染色法鉴定其内皮细胞特性.以10μmol/L ADMA及配制ADMA的溶剂(含0.5 % DMSO的EBM-2培养基),分别与第二代细胞孵育72h,检测并对比细胞的凋亡率、增殖能力及血管生成能力.结果 免疫细胞染色后可见细胞表面VIII因子相关抗原、CD34以及Flk-1均阳性表达,DiI-ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ荧光染色后可见双染色阳性细胞均为正在分化的EOC.ADMA组细胞凋亡率[(5.96±0.12)%]显著高于正常组[(1.48±0.03)%](P< 0.01),而细胞增值活性及血管生成活性(0.27、0.02、8.25、0.96)均明显弱于正常组(8.25、0.96、16.25、1.71)(P<0.05或0.01).结论 ADMA能促进EOC凋亡,抑制其增值活性及血管生成活性,其对EOC细胞功能的损伤作用可能是通过氧化应激机制实现的.
关键词： 内皮生长晕细胞 非对称性二甲基精氨酸 氧化应激 增殖能力 成血管能力 -
PKC对雷帕霉素抑制内皮生长晕细胞作用的影响及机制
目的 探讨蛋白激酶C(PKC)在雷帕霉素干预内皮生长晕细胞(EOCs)后所引起的EOCs功能抑制中的作用.方法 采用密度梯度离心法分离脐血单个核细胞,培养并扩增EOCs,采用免疫细胞法、荧光染色法鉴定EOCs特性.将培养的EOCs分别给予10 μmol/L的雷帕霉素(雷帕霉素组)、1μmol/L的PKC抑制剂Go6976预处理30 rmin后再加10 μmoL/L的雷帕霉素(Go6976+雷帕霉素组)、1μmoL/L的Go6976(Go6976组)组及配制雷帕霉素的溶剂(对照组),作用24 h后CCK-8检测细胞增殖能力,Transwell小室检测细胞迁移能力,倒置显微镜下检测细胞的黏附能力.结果 雷帕霉素组EOCs的增殖、迁移、黏附能力均低于对照组(P均＜0.01).Go6976+雷帕霉素组EOCs的增殖、迁移、黏附能力均高于雷帕霉素组(P均＜0.01).结论 雷帕霉素能够抑制EOCs的增殖、迁移、黏附能力.Go6976可以改善雷帕霉素对EOCs增殖、迁移、黏附的抑制作用.PKC可能参与了雷帕霉素对EOCs功能的抑制作用.
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血管内皮生长因子对内皮生长晕细胞冻存后复苏率及增殖、迁移能力的影响
目的 研究血管内皮生长因子对冻存后内皮生长晕细胞复苏率及其增殖、迁移能力的影响.方法 密度梯度离心法分离脐带血中单个核细胞,体外扩增培养内皮生长晕细胞,免疫组织化学法、荧光染色法鉴定内皮细胞特性.分别采用不合血管内皮生长因子和含50 μg/L血管内皮生长因子的冻存液对内皮生长晕细胞进行冻存,分为正常组、对照组、50 μg/L血管内皮生长因子组,24 h后复苏并观察细胞的复苏率及其增殖、迁移能力.结果 50 μg/L血管内皮生长因子组可提高冻存复苏后内皮生长晕细胞的复苏率.24 h内两组细胞增殖、迁移能力均较正常组减弱(P＜0.01),但50 μg/L血管内皮生长因子组显示对内皮生长晕细胞增殖、迁移能力的保护作用.48 h后50 μg/L血管内皮生长因子组细胞迁移能力较正常组增强(P＜0.01),增殖能力接近正常组(P＞0.05),但对照组在观察期间内细胞增殖和迁移能力均较正常组与50μg/L血管内皮生长因子组减弱(P＜0.01).结论 血管内皮生长因子可以提高冻存后内皮生长晕细胞的复苏率以及复苏后细胞的增殖、迁移能力.
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雷帕霉素及基质细胞衍生因子1α对内皮生长晕细胞生物学功能的影响
目的 观察基质细胞衍生因子1α对内皮生长晕细胞生物学功能的作用,以及探讨雷帕霉素对这种作用的影响.方法 分离脐血中单个核细胞,采用贴壁法培养内皮生长晕细胞.免疫细胞化学染色鉴定第二代细胞的内皮前体细胞特性.取第3代细胞分为四组,分别用10μg/L基质细胞衍生因子1α、10μg/L基质细胞衍生因子1α+1μg/L雷帕霉素、1μg/L雷帕霉素、普通培养液(空白对照)孵育内皮生长晕细胞24h.采用CCK-8法检测内皮生长晕细胞的增殖能力,划痕试验检测内皮生长晕细胞的迁移能力.结果 采用贴壁法培养的细胞具有多种内皮细胞特性.与10μg/L基质细胞衍生因子1α共同孵育的内皮生长晕细胞其增殖能力和迁移能力均得到活化(P＜0.01),但1μg/L雷帕霉素抑制了这种活化作用(P＜0.01).并且1μg/L雷帕霉素能够明显抑制内皮生长晕细胞的生物学功能(P＜0.05).结论 基质细胞衍生因子1α能够活化内皮生长晕细胞的增殖能力及迁移能力,雷帕霉素不但抑制内皮生长晕细胞本身的迁移能力,而且能够抑制内皮生长晕细胞的增殖能力并抵消基质细胞衍生因子1α对内皮生长晕细胞生物学功能的活化作用.
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内皮生长晕细胞冻存和复苏的可行性
目的 研究冻存对内皮生长晕细胞增殖能力和成血管能力的影响,探讨内皮生长晕细胞冻存和复苏的可行性.方法 分离脐血中单个核细胞,采用贴壁培养法培养扩增内皮生长晕细胞,免疫组织化学染色和荧光染色法鉴定其内皮细胞特性.扩增后的细胞采用浓度为650μmol/L(体积比为50 mL/L)和1040,μmol/L(体积比为80mL/L)二甲基亚砜的培养基冻存至液氮中,24 h后复苏并观察冻存细胞的复苏率、复苏后细胞的增殖能力和成血管能力的改变.结果 采用贴壁法培养的细胞具有多种内皮细胞特性.细胞采用含不同浓度二甲基亚砜(50 mL/L和80 mL/L)的培养基冻存后,其复苏率差异无统计学意义,细胞的增殖能力在复苏后36 h内50 mL/L、80 mL/L二甲基亚砜组均较未冻存组减弱(P＜0.05),72 h后三组间比较差异无统计学意义.而复苏后6 h内成血管速率较未冻存组减弱(P＜0.05),但30 h后三组间比较差异无统计学意义.结论 内皮生长晕细胞可以进行冻存和复苏.
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内皮生长因子对低温冻存内皮生长晕细胞增殖及黏附能力的影响
目的:探讨不同浓度血管内皮生长因子(vessel endothelial growth factor,VEGF)对内皮生长晕细胞(endothelial outgrowth cell,EOC)低温冻存过程中细胞生物学功能的保护作用.方法:采用密度梯度离心法分离脐血中的单个核细胞,培养扩增EOC,免疫组化、荧光染色及流式细胞仪检测其内皮细胞特性.第2代细胞用含0、10、25、50ng/mLVEGF的冻存液冻存,24 h后复苏,CCK-8法检测增殖能力；差速贴壁法检测黏附能力.结果:CD34+、KDR+、VE-Cadherin+细胞分别为(61.17±0.44)％、(34.79±6.31)％、(74.64±6.96)％.10ng/mLVEGF组与空白对照组相比,其增殖能力无统计学差异,而黏附能力得到一定程度的保护.25 ng/mLVEGF和50ng/mL VEGF组细胞复苏后的细胞增殖能力与黏附能力均较空白对照组增强.结论:VEGF能够不同程度地保护EOC在低温冻存中的生物学功能.
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非对称性二甲基精氨酸对内皮生长晕细胞凋亡和功能的影响
目的:探讨非对称性二甲基精氨酸(ADMA)对内皮生长晕细胞(EOCs)凋亡和功能的影响.方法:密度梯度离心法分离脐血单个核细胞,培养并扩增EOCs,免疫组化法、荧光染色法鉴定其内皮细胞特性.将浓度为0、1、5、10、30μmol/L的ADMA与EOCs作用48 h,流式细胞仪检测细胞凋亡率,DAPI染色观察凋亡细胞核形态变化,并在倒置显微镜下检测细胞的黏附能力和成血管能力.结果:ADMA(1～30μmol/L)呈浓度依赖性的诱导EOCs的凋亡(P<0.01).ADMA处理组于DAPI染色下可见更显著的细胞凋亡形态学改变.除1μmol/L ADMA外,5、10、30 μmol/L ADMA均可抑制EOCs的黏附能力.10 μmol/L ADMA作用组与对照组相比,明显降低细胞成血管能力(P<0.01).结论:ADMA可以诱导体外培养的EOCs发生凋亡并抑制其黏附能力和成血管能力.
关键词： 细胞凋亡 非对称性二甲基精氨酸 内皮生长晕细胞 -
纳米PLLA膜复合内皮生长晕细胞的相容性研究
目的 通过观察内皮生长晕细胞(EOCs)与纳米聚-L-乳酸(PLLA)有序纤维膜体外复合培养的生物相容性及黏附、增殖情况,为构建组织修复材料提供理论依据.方法 通过静电纺丝技术制备的纳米PLLA纤维支架,行低温等离子体技术改性及 Ⅰ 型胶原表面涂覆,与EOCs复合培养,测定细胞黏附率及增殖率,观察细胞生长曲线,荧光显微镜及扫描电镜下观察支架材料与种子细胞EOCs形态特征和生物相容性.结果 制备的纳米PLLA膜孔径在300～400 nm之间,孔隙率>90%.各组(单纯细胞组、无序膜组、有序膜组及超级有序膜组)吸光度(A)值均随共培养时间的增加而逐步升高; 从第5天起,有序膜和超级有序膜组A值与无序膜和单纯细胞组比较,差异有统计学意义(P＜0.05); 单纯细胞组和无序膜组各检测时间点A值差异无统计学意义(P>0.05 ).复合培养12 h及24 h后有序膜组和超级有序膜组黏附率则明显高于无序膜组,差异有统计学意义(P＜0.01).复合培养1 d、3 d及7 d后,有序膜组和超级有序膜组的增殖率明显高于无序膜组(P＜0.05,P＜0.01).细胞在支架膜上生长良好,纳米无序膜的细胞生长较散在、杂乱; 有良好空间定向效果的有序膜及超级有序膜支架有利于细胞沿纤维定向附着、伸展、增殖,以超级有序膜更有利于保持其结构.结论 EOCs是理想的组织工程种子来源细胞; 纳米PLLA有序及超级有序膜支架能促进种子细胞在材料表面的黏附、增殖,并能较好地保持细胞的形态,是一种理想的组织修复材料.
