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糖肾清2号方对糖尿病肾病小鼠AMP激活蛋白激酶信号通路的影响
目的 观察糖肾清2号方对糖尿病肾病模型小鼠AMP激活蛋白激酶(AMPK)信号通路的影响.方法 采用自发性2型糖尿病模型KK-Ay小鼠,予高脂饲料诱导3周诱导糖尿病肾病模型.造模成功的小鼠随机分为模型组,阳性药组,中药大、中、小剂量组,以C57BL/6J小鼠设为正常组,每组各6只.正常组及模型组予去离子水0.1 mL/(10 9·d),阳性药组予缬沙坦13.33 mg/(kg·d),中药大、中、小剂量组分别按照糖肾清2号方生药量40.66、20.33、10.17 g/(kg·d)剂量灌胃.各组小鼠每日灌胃1次,连续干预治疗12周后取血清及肾脏.采用RT-PCR技术检测肾脏组织AMPK-α1、NF-κB P65、TNF-α、IL-6mRNA转录水平.Western blot技术、免疫组化法测定肾脏组织AMPK-α1、NF-κB P65蛋白表达水平.ELISA法检测血清TNF-α、IL-6蛋白表达水平.结果 与正常组比较,模型组AMPK-α1 mRNA转录水平及蛋白表达水平明显下调(P＜0.01),NF-κB P65、IL-6、TN F-αmRNA转录水平及蛋白表达水平明显上调(P＜0.01).与模型组比较,中药大、中、小剂量组AMPK-α1 mRNA及蛋白表达均有上调(P ＜0.05,P＜0.01),NF-κB P65、IL-6、TNF-αmRNA及蛋白表达水平均明显下调(P ＜0.05,P＜0.01).与阳性药组比较,中药各组AMPK-α1 m RNA转录水平及蛋白表达水平明显下调(P＜0.01),NF-κB P65、TNF-α、IL-6 mRNA水平均明显上调(P＜0.01),NF-κB P65、IL-6蛋白表达水平均明显上调(P ＜0.05,P＜0.01);中药大、中剂量组TNF-α蛋白表达水平明显下调(P＜0.05).结论 糖肾清2号方对肾脏的保护作用可能与激活AMPK-α1活性,间接抑制NF-κB活性从而抑制炎症反应有关.
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AMP激活蛋白激酶与肥厚型心肌病关系的研究进展
肥厚型心肌病是一种常染色体显性遗传的单基因疾病,其致病机理还不是十分明确.越来越多的研究表明AMP激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)与该病的发病有重要关系.AMPK是一种细胞能量状态的感受器,在心肌细胞的能量平衡中起关键作用;AMPK能够通过影响翻译起始阶段和肽链延长阶段来抑制蛋白合成,从而抑制肥厚;PRKAG2编码AMPKγ2 subunit,其突变可以导致HCM合并WPW综合征.
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单磷酸腺苷激活蛋白激酶的活性调节
AMP激活蛋白激酶(AMPK)是参与细胞及全身水平能量代谢调节的一个关键分子,AMPK通过各种途径激活后可以刺激分解代谢途径(脂肪酸氧化、线粒体的生物合成和糖酵解)和抑制合成代谢途径(糖原、葡萄糖、蛋白质及脂肪酸的合成),并具有直接调节下丘脑对食欲的影响,被称为"能量开关".现就AMPK活性调节机制的研究进展进行综述.
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运动对动脉粥样硬化大鼠血管内皮细胞AMPK激活的研究
目的:研究不同强度运动对大鼠血管内皮细胞的AMP激活蛋白激酶(AMPK)的蛋白表达及其磷酸化的影响,探讨运动改善心血管健康的分子机制.方法:48只Wistar大鼠,分为对照组(C组)、模型组(AS组)、低强度运动模型组(ASL)和高强度运动模型组(ASH).研究血清白介素-6(IL-6)、肿瘤抑制因子-α(TNF-α)、C反应蛋白(CRP)等炎性因子的浓度,并采用Western blot方法测定大鼠内皮细胞的总AMPK和p-AMPK蛋白量.结果:①AS组IL-6水平与对照组没有显著差异,ASH组则明显升高,与对照组或AS组相比均有显著差异；AS组和ASL组血清TNF-α水平明显高于对照组,但是ASH组和ASL显著低于AS组；AS造模后,各组血清CRP水平均显著高于对照组,各AS造模组间无统计学差异.②ASL和AAH组总AMPK蛋白量明显高于对照组和AS组,与两组相比均有统计学差异.③ASL和ASH组的p-AMPK蛋白均显著高于AS组,ASH组同时显著高于对照组.结论:运动可以降低动脉粥样硬化大鼠的血清炎症因子水平,同时增加血管内皮细胞的AMPK蛋白表达和磷酸化程度.
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丙型肝炎病毒核心蛋白下调AMP激活蛋白激酶导致肝细胞糖代谢紊乱
目的 探讨HCV核心蛋白对AMP激活蛋白激酶(AMPK)表达及肝细胞葡萄糖代谢的影响.方法 表达HCV核心蛋白的质粒转染L02人肝细胞.分别应用液体闪烁计数仪、实时荧光定量-PCR、Western印迹检测AMPK活性、mRNA及蛋白的表达.应用放射同位素法和葡萄糖氧化酶法测定肝细胞葡萄糖摄取率和糖异生.采用6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联比色法和乳酸脱氢酶偶联比色法测定葡萄糖激酶(GK)和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)活性.RT-PCR检测AMPK下游调节糖代谢的基因的葡萄糖转运蛋白(GLUT)1、GLUT2、PEPCK、葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)和GK mRNA水平.结果 与转染空载体的L02人肝细胞相比,表达HCV核心蛋白L02人肝细胞AMPK α2活性[(0.2±0.05)比(1.0±0.3),t=6.443,P＜0.01]、AMPK α2 mRNA[(0.3±0.05)比(1.0±0.3),t=5.638,P＜0.01]及磷酸化-AMPK蛋白的表达水平[(0.2±0.05)比(0.6±0.2),t=4.753,P＜0.01]明显下降,PEPCK活性[mIU/min/mg蛋白:(35.80±8.70)比(25.50±5.80),t=2.413,P＜0.05]明显升高,而GK活性[mIU/min/mg蛋白:(1.70±0.35)比(3.55±0.84),t =4.929,P＜0.01]明显降低,葡萄糖摄取率[cpm:(5000±800)比(20000±5000),t=7.256,P＜0.01]及其调节基因GLUT2 mRNA水平[(0.5±0.1)比(1±0.3),t=3.873,P＜0.01]明显下降；糖异生[(2.5±0.5)比(1.0±0.2),t =6.823,P＜0.01]及其调节基因PEPCK[(2.8±0.7)比(1.0±0.3),t=5.789,P＜0.01]、G6Pase mRNA水平[(2.5±0.5)比(1.0±0.2),t=6.822,P＜0.01]明显升高；GK mRNA水平[(0.6±0.1)比(0.9±0.3),t=2.324,P＜0.05]明显下降.结论 HCV核心蛋白下调AMPK活性及表达,改变其下游调节糖代谢相关基因表达,降低葡萄糖摄取能力,增加糖异生,导致肝细胞葡萄糖代谢紊乱.
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丙型肝炎病毒核心蛋白下调AMP激活蛋白激酶对肝细胞脂类代谢的影响
目的 探讨HCV核心蛋白对AMP激活蛋白激酶(AMPK)表达及肝细胞脂类代谢的影响.方法 表达HCV核心蛋白的质粒转染HepG2细胞.分别应用液体闪烁计数仪、实时荧光定量-PCR(RT-PCR)、Western印迹检测AMPK活性、mRNA及蛋白的表达.试剂盒检测三酰甘油、总胆固醇(TC)的含量,液闪计数仪检测脂肪酸β氧化速度,流式细胞仪、硫代巴比妥酸比色法、黄嘌呤氧化酶法分别测定活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性.RT-PCR检测AMPK下游调节脂类代谢的基因固醇调节元件结合蛋白(SREBP)-1c、脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、SREBP-2、羟甲基戊二酸单酰CoA还原酶(HMGR)、羟甲基戊二酸单酰CoA合成酶(HMGS)、过氧化物酶体增殖活化受体(PPAR)α、PPAR y、肉碱脂酰转移酶1(CPT1) mRNA水平.结果 与转染空载体的HepG2细胞相比,表达HCV核心蛋白HepG2细胞AMPKα2活性(0.2±0.05比1.0±0.2,t=9.505,P＜0.01)、AMPK α2 mRNA(0.3±0.1比1.0±0.3,t=5.422,P＜0.01)及磷酸化-AMPK蛋白的表达水平(0.25±0.05比0.6±0.2,t=4.159,P＜0.01)明显下降,细胞内三酰甘油含量[(78.5±20.5)μg /mg比(40.5±11.0)μg /mg,t=4.078,P＜0.01]和TC含量[(52.5±13.0)μg /mg比(32.0±8.5)μg /mg,t=3.233,P＜0.01]明显升高,脂肪酸β氧化速度[(1.80±0.40) nmol·mg-1·h-1比(3.10±0.60)nmol· mg-1·h-1,t=4.416,P＜0.01]明显减慢,ROS水平(3.8±0.7比1.0±0.2,t=9.421,P＜0.01)明显升高,MDA含量[(8.50±2.40) nmoI/mL比(3.00±0.60) nmol/mL,t=5.446,P＜0.01]明显升高；SOD活性[(9.60±2.50) U/mL比(15.50±3.00)U/mL,t=3.764,P＜0.01]明显降低.脂肪酸、胆固醇合成的相关基因SREBP-1cmRNA水平(1.9±0.4比1.0±0.3,t=4.409,P＜0.01)、FAS mRNA水平(3.0±0.6比1.0±0.3,t=7.303,P＜0.01)、ACC mRNA水平(2.6±0.5比1.0±0.3,t=6.721,P＜0.01)、SREBP-2 mRNA水平(2.3±0.5比1.0±0.2,t=5.913,P＜0.01)、HMGR mRNA水平(1.9±0.4比1.0±0.2,t=4.929,P＜0.01)和HMGS mRNA水平(2.6±0.7比1.0±0.2,t＝ 5.383,P＜0.01)明显升高,脂肪酸β氧化的相关基因PPARα mRNA水平(0.3±0.1比1.0±0.3,t=6.971,P＜0.01)和CPT1A mRNA水平(0.4±0.1比1.0±0.2,t=6.573,P＜0.01)明显下降.结论 HCV核心蛋白下调AMPK活性及表达,改变其下游调节脂类代谢相关基因表达,增加三酰甘油和TC合成,减少脂肪酸β氧化,增加脂质过氧化,导致肝细胞脂类代谢紊乱.
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中国人群PRKAG2心脏综合征新突变的PRKAG2基因的功能分析
目的 研究中国人群家族性传导系统异常伴心室预激及心肌肥厚患者新错义突变的PRKAG2基因表达和功能变化.方法 利用PCR扩增其功能区外显子片段,双脱氧末段终止测序法来构建表达PRKAG2 G100S、PRKAG2 R302Q及野生型(WT) PRKAG2基因的慢病毒载体,并对其从细胞学水平进行体外实验研究.结果 (1) PRKAG2 G100S和PRKAG2 R302Q突变对PRKAG2基因在CCL13细胞中的表达位置没有影响;(2) PRKAG2突变组CCL13/GS和CCL13/RQ与CCL13/WT组相比,PRKAG2蛋白表达量减少,且细胞质及胞核内有较多糖原沉积;(3)PRK AG2基因G100S和R302Q突变降低了CCL13细胞中的AMPK活性,而G100S突变降低AMPK活性的作用弱于R302Q突变(P＜0.05或P＜0.01).结论 PRKAG2 G100S突变是中国人PRKAG2心脏综合征家系的发病原因,初步证实了突变导致AMPK活性降低及糖原累积是家系的发病机制;G100S突变可能使PRKAG2基因Bateman结构域功能发生变化,但对Bateman结构域功能的影响弱于R302Q突变.
关键词： PRKAG2心脏综合征 PRKAG2基因 AMP激活蛋白激酶 -
抵抗素在肝脏胰岛素抵抗中的作用及其机制探讨
目的 探讨抵抗素在肝脏胰岛素抵抗中的作用及其可能的机制.方法 将载有抵抗素基因的重组腺病毒经尾静脉注射构建高抵抗素血症小鼠模型,同时设正常对照组及病毒对照组,取肝脏组织切片行PAS糖原染色半定量观察肝糖代谢变化;以Western blot检测肝腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的磷酸化,以磷酸化AMPK/总AMPK的比值代表AMPK激活程度;以实时PCR检测肝组织糖异生关键酶葡萄糖6磷酸酶(G6Pase)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEP-CK)mRNA表达水平的变化.结果 重组腺病毒注射d 5获得血中抵抗素高表达构建了高抵抗素血症动物模型,糖原染色示高抵抗素血症小鼠肝糖原含量较正常对照及病毒对照组降低(P<0.05);高抵抗素血症组肝AMPK磷酸化水平较正常对照及病毒对照组下降,磷酸化AMPK/总AMPK比值分别为0.78±0.06 vs 0.93±0.13,0.89±0.05(P<0.05).高抵抗素血症小鼠G6Pase和PEPCK的mRNA表达升高,G6Pase分别为2.136±0.857 vs 1.353±0.49,1.250±0.77;PEPCK分别为3.54±0.90 vs 2.75±0.78,2.63±0.67(P<0.05).结论 抵抗素可能通过抑制肝脏AMPK活性,增加肝糖异生关键酶的表达而影响机体肝糖代谢,降低肝糖储量,参与肝脏胰岛素抵抗的形成.
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抵抗素对内皮细胞活性氧生成及AMPK磷酸化水平的影响
目的 探讨抵抗素对内皮细胞功能影响的作用机制.方法 体外培养人脐静脉内皮细胞,50、100 ng/ml抵抗素干预24 h,分别检测活性氧(ROS)生成和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)磷酸化水平,并应用AICAR激活AMPK观察其对内皮ROS生成的影响.结果 50、100 ng/ml 抵抗素作用组与对照组相比,内皮细胞 AMPK磷酸化水平明显下降,而ROS生成无明显改变;50 ng/ml 抵抗素作用组加用AICAR干预后,AMPK磷酸化水平显著增高,同时伴ROS生成显著降低.结论 抵抗素可影响内皮细胞功能,其机制可能通过抑制内皮细胞AMPK的磷酸化水平,参与内皮细胞炎症过程的调节,激活内皮AMPK,减少ROS生成,对内皮损伤起保护性作用.
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AMPK,SIRT1与能量代谢
在调节细胞能量状态的蛋白激酶级联反应中,AMP 激活的蛋白激酶(AMPK) 是其中枢组成部分,AMPK的活性受AMP/ATP比值的调节.沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)作为一种NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶,同样在调节细胞能量代谢中起着重要作用.AMPK与SIRT1相互起调控作用,阐明AMPK与SIRT1作用的上下游信号通路有可能成为新的治疗代谢疾病作用靶点.
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降钙素基因相关肽抑制血管平滑肌细胞能量代谢的AMP激活蛋白激酶信号通路
目的 观察降钙素基因相关肽对血管紧张素Ⅱ诱导血管平滑肌细胞增殖过程中能量代谢的影响及机制,探索细胞外信号调节激酶和AMP激活蛋白激酶相关信号蛋白在该作用中的地位.方法 组织贴块法体外培养SD大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,取第3～10代用于实验.分别用降钙素基因相关肽或/和血管紧张素Ⅱ处理细胞.MTr法及细胞计数法观察降钙素基因相关肽对血管紧张素Ⅱ诱导大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响;詹纳斯绿B染色观察细胞线粒体形态及体积;ATP检测试剂盒检测细胞内ATP水平;Western Blotting检测细胞磷酸化AMP激活蛋白激酶的表达.结果 降钙素基因相关肽预处理能降低血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠血管平滑肌细胞的增殖(P<0.05),同时拮抗血管紧张素Ⅱ引起细胞内线粒体肿胀、ATP水平升高,在此过程中伴随细胞内磷酸化AMP激活蛋白激酶表达下调(P<0.05);降钙素基因相关肽受体拮抗荆CGRP8-37能拮抗降钙素基因相关肽对血管紧张素Ⅱ促增殖和促代谢的抑制作用(P<0.05);细胞外信号调节激酶抑制剂PD98059能部分拮抗降钙素基因相关肤对磷酸化AMP激活蛋白激酶的抑制作用(P<0.05).结论 降钙素基因相关肽能显著抑制血管紧张素Ⅱ诱导大鼠血管平滑肌细胞增殖过程中的能量代谢,其细胞内信号通路可能涉及到降钙素基因相关肽/降钙素基因相关肽1型受体-丝裂原细胞外激酶/细胞外信号调节激酶-磷酸化AMP激活蛋白激酶信息传递链.
