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土荆皮乙酸B对膀胱癌5637细胞增殖和凋亡的影响
目的:研究二萜类化合物土荆皮乙酸(pseudolaricc acid B)诱导膀胱癌5637细胞凋亡的作用,探讨其作用机制.方法:MTT法测定不同浓度土荆皮乙酸作用后5637细胞的生长情况；流式细胞术检测细胞周期情况；AnnexinV -FITC/PI双染流式细胞术观察土荆皮乙酸作用后细胞的凋亡情况；免疫印迹法检测survivin和caspase-3蛋白表达的变化.结果:土荆皮乙酸能诱导5637细胞凋亡,并明显抑制survivin的表达,同时对caspase-3有上调作用.结论:土荆皮乙酸在体外可抑制5637细胞增殖,诱导其发生凋亡.土荆皮乙酸诱导5637细胞发生凋亡的生物学效应可能与survivin的表达下降,caspase-3的表达上升有关.
关键词： 土荆皮乙酸 膀胱癌 凋亡 survivin因子 caspase-3因子 -
超声波提取土荆皮中土荆皮乙酸的工艺研究
目的 优选土荆皮中土荆皮乙酸的超声波提取工艺.方法 HPLC法测定含量,采用正交设计,以土荆皮乙酸的收率为判断指标,以提取液浓度、固液比、提取时间为考察因素,优选佳提取工艺.结果 确定佳工艺为用90％乙醇按1∶12的料液比超声提取20 min,在佳提取条件下土荆皮乙酸的提取率为0.49％.结论 与传统的提取方法(浸渍法、渗漉法)相比,超声波提取方法提取具有省时、溶剂节约、高效等优势.
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土荆皮乙酸的代谢产物和代谢途径
综合运用体内实验和多种体外实验模型,分析了土荆皮乙酸(pseudolaric acid B,PB)的代谢情况.在口服和静脉注射给药实验中,使用HPLC和HPLC-ESI/MS”方法在大鼠血、尿、粪和胆汁样品中都检测到去甲基土荆皮乙酸(土荆皮丙2酸,pseudolaric acid C2,PC2),各种样品中几乎都检测不到原形药物,PC2是PB特异性的代谢产物.PB在肠内菌抑制大鼠模型中的代谢情况与正常组一致,说明其代谢与肠内菌无关.在人工胃、肠液中分别孵育48 h均无明显变化,说明胃蛋白酶和胰蛋白酶都不是主导PB代谢的因素,在胃肠道的pH环境下PB也是稳定的.在体外大鼠肝微粒体孵育模型中,PB仅有极少部分被代谢成为脱甲氧基或脱甲氧基脱羧基的产物,说明其代谢也不是由肝微粒体酶主导的.在体外全血孵育模型中,PB在1h内被逐渐代谢成PC2,并表现出了与孵育时间相关的动力学特点.由此推测土荆皮乙酸一进入血液就被迅速代谢成PC2,以致于在各种样品中都几乎检测不到原形药.这种快速的代谢应该是通过血浆酯酶对PB的C-19酯键的迅速水解而实现的.本文首次初步阐明了PB在体内的代谢途径,对于明确中药土荆皮的有效物质基础、体内活性形式及其作用机制都具有重要意义.
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土荆皮总二萜酸的代谢产物和代谢途径
综合运用体内实验和多种体外实验模型,初步分析了土荆皮总二萜酸(total diterpene acid,TDA)的代谢情况.在口服和静脉注射给药实验中,使用HPLC-UV和HPLC-ESI/MSn方法在大鼠血、尿、粪和胆汁样品中都检测到主要代谢产物土荆皮丙2酸(pseudolaric acid C2,PC2),还可检测到脱甲氧基脱乙酰氧基土荆皮乙酸(demethoxydeacetoxypseudolaric acid B,DDPB),以及推测为土荆皮丙2酸的葡萄糖苷(PC2G)的代谢产物,原形药物中的土荆皮丙酸(pseudolaric acid C,PC)、土荆皮甲酸(pseudolaric acid A,PA)、土荆皮甲酸葡萄糖苷(pseudolaric acid A O-β-Dglucopyranoside,PAG)、土荆皮乙酸葡萄糖苷(pseudolaric acid B O-β-D glucopyranoside,PBG)和脱乙酰基土荆皮甲酸(deacetylpseudolaric acidA,DPA)也可以检测到.实验表明,TDA的代谢与肠内菌无关,胃蛋白酶和胰蛋白酶不是主导TDA代谢的因素,在胃、肠道的pH环境下TDA也是稳定的.TDA在体外全血孵育模型中的主要代谢产物是PC2、DDPB和PC2G,证明TDA在体内的代谢转化反应主要是在血液中完成的,并且主要归结于血浆酯酶对酯键的水解以及葡萄糖苷化反应.这一发现首次初步阐明了TDA在体内的代谢途径,对于明确土荆皮的有效物质基础、体内活性形式及其作用机制都具有非常重要的意义.
关键词： 土荆皮 总二萜酸 土荆皮乙酸 土荆皮丙2酸 脱甲氧基脱乙酰氧基土荆皮乙酸 -
土荆皮乙酸的研究进展
土荆皮是我国特有松科植物金钱松的干燥根皮或近根树皮，载于赵学敏的《本草纲目拾遗》。土荆皮性辛、温、有毒，其醇提物多用于治疗手足癣等。土荆皮乙酸是从土荆皮中分离得到的一种具有二萜酸结构的化合物（见图1），具有抗菌、抗肿瘤、抗生育、胆囊自截等多种生物活性［1］。近年来，对土荆皮乙酸的研究越来越多，尤其是其抗肿瘤活性引起了国内外学者的关注。本文概述了土荆皮乙酸的来源、理化性质、生物活性和应用前景，以期为深入了解土荆皮乙酸提供参考。
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土荆皮的研究进展
土荆皮又名土槿皮，为我国特有松科植物金钱松的干燥根皮或近根树皮，始载于赵学敏的《本草纲目拾遗》，近代中药专著均有收载，亦是《中华人民共和国药典》收载的常用中药，分布于江苏、安徽、浙江、江西等地长江中下游温暖的地区［1］。土荆皮主要含有土荆皮甲酸、土荆皮乙酸、土荆皮乙酸葡萄糖苷等二萜类化合物，具有杀虫止痒、祛风除湿的作用。近年来发现土荆皮在临床上对手癣、脚癣、体癣等疗效显著，且土荆皮多种化学成分具有抗真菌、抗肿瘤、抗血管生成等活性。笔者现将土荆皮的化学成分、药理作用及毒性反应、临床应用等研究作一总结，为深入研究土荆皮提供参考。
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HPLC法同时测定复方土荆皮酊中4种二萜类成分
目的 建立同时测定复方土荆皮酊(土荆皮等)中土荆皮乙酸-0-β-D-葡萄糖苷、土荆皮丙酸、土荆皮乙酸和土荆皮甲酸4种二萜类成分的HPLC法.方法 采用Agilent Zorbax SB C18(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱,以乙腈(A)-0.09％甲酸(B)为梯度洗脱流动相,体积流量1.0 mL/min,柱温35℃,检测波长为262 nm.结果 土荆皮乙酸-0-β-D-葡萄糖苷、土荆皮丙酸、土荆皮乙酸和土荆皮甲酸分别在11.598 ～ 82.845 μg/mL,1.206～ 27.009μg/mL,14.746 ～ 126.392 μg/mL和0.159-2.274 μg/mL范围内线性关系良好；4种成分的平均加样回收率(n＝6)分别为99.0％(RSD为0.29％)、99.5％(RSD为0.15％)、101.5％(RSD为0.17％)和99.1％(RSD为0.26％).结论 该方法操作简便,准确度高,能够更好的用于复方土荆皮酊的质量控制.
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三种土荆皮乙酸醇提工艺的比较
土荆皮(Cortex Pseudolaricis)来源于松科植物金钱松(Pseudolarixkaempferi Gord)的根皮和近根树皮,性辛温,有毒,用于治疗手足癣、神经性皮炎、湿疹等[1].其醇提物与苯甲酸、水杨酸制成的复方土荆皮酊具有良好的止痒、抗真菌的作用,广泛用于手足癣、体癣的治疗.新研究表明,土荆皮中特征性的二萜酸类成分是其抗真菌、抗肿瘤、抗生育和抗血管生成的主要有效成分,其中土荆皮乙酸(pseudolaric acid B,PAB)含量高、活性强[2-5].目前,土荆皮乙酸通常采用乙醇浸渍法提取,该方法提取效率低下,有效成分提取不完全.文献调研发现国内对土荆皮乙酸的醇提取工艺缺乏系统研究,为此,笔者建立高效液相(HPLC)法测定土荆皮乙酸的含量,设计正交实验优化土荆皮乙酸的醇提工艺,比较三种提取方法对土荆皮乙酸提取率的影响.
关键词： 土荆皮 土荆皮乙酸 提取工艺 正交实验 高效液相(HPLC) -
HPLC法同时测定复方蛇床酊中蛇床子素和土荆皮乙酸的含量
目的:建立可同时测定复方蛇床酊中蛇床子素和土荆皮乙酸含量的HPLC法.方法:色谱柱:Apollo Ct8(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相:甲醇-1%醋酸溶液(65:35),流速:1.0 ml·min-1;检测波长:322 nm.结果:蛇床子素和土荆皮乙酸分别在0.010～0.080μg(r=0.999 8)和0.005～0.040μg(r=0.999 6)范围内呈良好的线性关系;平均回收率分别为99.50%和98.78%,RSD分别为1.94%和1.42%.结论:该方法简便易行,结果准确,重复性好,可用于控制复方蛇床酊的质量.
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高效液相色谱法测定土荆皮药材中土荆皮乙酸的含量
目的:建立土荆皮药材中土荆皮乙酸的含量测定方法.方法:用甲醇提取,采用Merck-C18色谱柱(4.6mm×250 mm,4μm),甲醇-0.1%H3PO4水(65:35)为流动相,检测波长为256 nm.结果:土荆皮乙酸在10-50μg·ml-1范围呈良好的线形关系,r=0.9999;平均回收率99.1%,RSD=1.5%;稳定性是RSD=1.5%.结论:该方法能消除其它成分的干扰,准确可靠,重现性好,操作简单快速.
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微管色谱柱测定止痒搽剂中土荆皮乙酸含量
目的 建立微管色谱柱测定止痒搽刺中土荆皮乙酸含量的方法.方法 采用Microsil C18色谱柱(150 mm×1.0 mm,5μm),以甲醇-1%醋酸溶液(60:40)为流动相,流速为50μL/min,检测波长为260 nm.结果 土荆皮乙酸质量浓度在3～30μg/mL范围内与峰面积线性关系良好(r=0.999 7),平均回收率为98.86%,RSD=0.72%(n=6).结论 与常规色谱柱相比,该法溶剂消耗少、灵敏度高.
