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补肾助孕方调节生殖轴促进胚胎着床的机制探讨
补肾助孕方是基于国医大师夏桂成教授提出的“心(脑)-肾-子宫轴”理论指导下形成的经验方剂.临床研究已证实,其为治疗黄体功能不全性(LPD)不孕症的有效方药,并能提高患者胚胎着床期P、LH等水平,实验结果提示其能改善卵巢黄体功能及子宫内膜容受性.基于中西医对LPD性不孕为生殖轴功能失调认识上的一致性,课题组认为补肾助孕方能够作用于垂体,提出“通过GnRH受体后信号通路调控垂体GTH表达进而调节生殖轴功能”的作用新机制假说.首次从GnRH受体后PKC-MAPK、Ca2+-CAM、cAMP-PKA信号通路,开创性地研究补肾助孕方对垂体GTH表达分泌的调控及补肾法治疗LPD的助孕新机制,为中药治疗LPD不孕症的研究提供新思路和新方法.
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大鼠胃壁细胞GnRH受体的定位及GnRH类似物对壁细胞内钙的影响
目的观察促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)受体在培养的大鼠胃粘膜壁细胞中的定位,并探讨GnRH类似物阿拉瑞林(alarelin)对壁细胞内游离钙动员的机制.方法采用免疫组织化学和原位杂交技术;应用Ca2+指示剂Fluo-3-AM作为细胞内钙离子的荧光探针,对负载培养的胃壁细胞,应用激光共聚焦显微镜技术检测单个细胞内钙荧光强度的变化.结果大鼠胃壁细胞呈GnRH受体免疫反应阳性,阳性物质位于细胞质,细胞核为阴性;同样壁细胞内可检测到GnRH受体mRNA杂交信号,阳性物质位于细胞质,细胞核为阴性;胞内Ca2+浓度变化为:1.在Hank液中,GnRH类似物浓度为10-8、10-7、10-6 mol/L时,胃壁细胞内Ca2+浓度逐渐升高,其峰高(峰值减去静息值)分别为7.1±1.4、12.1±1.7、16.8±2.2.其达峰时间也逐渐增快,分别为34.2±6.4s、18.9±1.2s、10.4±2.3s.相邻两组间其峰高及达峰时间均存在显著性差异(P＜0.05),且呈明显剂量依赖性.2.在D-Hank液(去除外钙)中,阿拉瑞林可轻度短暂升高胞内Ca2+;用内罗啶孵育后再加入阿拉瑞林也可轻度短暂升高胞内Ca2+,二者无显著性差异.3.当用拉西地平孵育后再加入阿拉瑞林,可明显抑制胞内Ca2+的增加.4.当用PLC(磷酸脂二酶)抑制剂和PKC(蛋白激酶C)抑制剂孵育后,再加阿拉瑞林,其胞内Ca2+升高仍受到抑制,明显小于单独应用10-6 mol/L的阿拉瑞林组(P＜0.01).结论大鼠胃壁细胞能自身表达GnRH受体;GnRH类似物可明显升高胃壁细胞内Ca2+浓度,且胞内Ca2+的增加主要源于外钙的内流,部分源于内钙的释放.其中细胞外钙的内流主要是通过L-型钙通道实现的.
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大鼠消化道促性腺激素释放激素受体的免疫组织化学研究
目的探讨大鼠消化道是否存在GnRH受体及其定位. 方法采用兔抗GnRH抗独特型抗体的免疫组织化学ABC法. 结果胃底腺壁细胞、胃小凹上皮细胞及肌间神经丛的副交感神经节细胞呈GnRH受体免疫反应性.三段小肠绒毛上皮细胞、潘氏细胞、十二指肠腺上皮细胞以及小肠肌间神经丛副交感神经节细胞,均呈较强的GnRH受体免疫反应性.在盲肠、结肠和直肠,粘膜上皮细胞、肠腺上皮细胞及肌间神经丛呈GnRH受体免疫反应性.阳性物质均分布在胞质内,胞核呈阴性. 结论大鼠消化道广泛分布有GnRH受体,其分布模式与先前GnRH及GnRH-mRNA的相类似.说明胃肠道的一些细胞分泌的GnRH可能以自分泌或旁分泌的方式参与消化功能的调节.
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大鼠颌下腺GnRH受体基因的体外扩增及基因序列分析
目的研究大鼠颌下腺GnRH受体基因的存在及其基因序列.方法从SD大鼠颌下腺提取总RNA,用RT-PCR法扩增GnRH受体基因,利用双脱氧链终止法对扩增产物进行序列测定.结果从SD大鼠颌下腺扩增出GnRH受体基因的特异性条带,经序列分析,扩增产物的基因序列与文献报道大鼠脑垂体的完全一致.结论大鼠颌下腺有GnRH受体基因的表达,能合成GnRH受体,是GnRH的靶器官,颌下腺产生的GnRH可作用于颌下腺的靶细胞,参与颌下腺生理功能的调节.
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培养的大鼠胃平滑肌细胞GnRH受体的免疫组织化学及原位杂交研究
目的观察培养的大鼠胃平滑肌细胞中是否能表达GnRH受体,为进一步研究GnRH对胃平滑肌细胞的功能提供形态学依据.方法采用免疫组织化学SABC和原位杂交方法.结果培养的大鼠胃平滑肌细胞呈GnRH受体免疫反应阳性,阳性物质分布于细胞浆和细胞膜上,细胞核呈阴性反应.培养的胃平滑肌细胞同样含有GnRH受体mRNA杂交信号,信号物质亦分布于细胞浆内,细胞核呈阴性反应.结论胃平滑肌细胞能自身表达GnRH受体,它可能也是GnRH的靶细胞.
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促性腺激素释放激素受体
促性腺激素释放激素(GnRH)受体为7次跨膜结构G蛋白耦联受体,介导GnRH活性.GnRH受体活化与受体结构构象改变相关.GnRHⅡ型受体基因读码框移码突变,GnRHⅡ可能通过GnRHI型受体转导信号.详细描述GnRH配体结合、受体激活及细胞内信号传导.通过氨基酸替代和修饰的方法,合成肽类GnRH激动剂(GnRHa)和拮抗剂(GnRHA).喹诺酮和噻吩吡啶衍生物可作为非肽类GnRHA.
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重组GnRH主动免疫公猪的效果及对垂体GnRH受体、FSHβ和LHβ基因表达的影响
目的:探讨重组GnRH六聚体-麦芽糖结合蛋白(MBP-GnRH-6)主动免疫的去势效果和对垂体GnRH受体、FSHβ和LHβ mRNA的影响.方法:7头公猪在9周龄时用重组GnRH主动免疫,放免法测血清睾酮浓度,ELISA法测抗体效价,实时荧光定量PCR分析垂体中GnRH受体、FSHβ和LHβ mRNA的变化.结果:重组MBP-GnRH-6主动免疫公猪后,血清GnRH抗体效价显著上升,且降低了外周血清睾酮浓度(P＜0.05),睾丸重量也明显下降((P＜0.01),组织切片显示,曲细精管仅有少数退化的精原细胞.免疫组公猪垂体中FSHβ mRNA和LHβ mRNA显著下降(P＜0.05),GnRH受体mRNA与阉割公猪相比差异显著(P＜0.05),但是与未阉割公猪相比差异不显著(P＞0.05).结论:公猪接种重组MBP-GnRH-6能诱发免疫反应,中和内源GnRH的生物活性,降低了垂体GnRH受体、FSHβ和LHβ基因表达,且抑制睾酮的合成,从而导致性器官发育受阻.
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大鼠消化道促性腺激素释放激素受体和胰高血糖素的免疫组织化学
目的:观察大鼠胃肠道胰高血糖素免疫反应阳性细胞(EG细胞)分布情况及大鼠回肠促性腺激素释放激素(GnRH)受体和高血糖素的共存关系.方法:免疫组化SABC法.结果:EG细胞散在分布于大鼠回肠和结肠的腺上皮细胞间,阳性物质分布于细胞质.大鼠胃、十二指肠、空肠未见EG细胞分布.回肠邻片免疫染色结果显示EG细胞呈GnRH受体免疫反应阳性.结论:大鼠胃肠道内只有回肠和结肠存在胰高血糖素细胞.回肠内的胰高血糖素细胞可能存在GnRH受体,GnRH可能以自分泌或旁分泌的方式对肠道内EG细胞所分泌的胰高血糖素进行调节.
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补肾助孕方对LPD模型大鼠垂体GnRH受体信号转导系统的影响
目的 通过观察补肾助孕方对大鼠垂体促性腺激素及促性腺激素释放激素(GnRH)受体信号系统的影响,探究其作用机制,寻找中医心-肾-子宫轴理论的现代科学依据.方法 采用米非司酮对SD雌鼠进行造模,并进行药物干预.采用ELISA法检测大鼠血清样本促黄体生成激素(LH)和促卵泡成熟激素(FSH)水平,qPCR法检测各组大鼠垂体 FSHβ、LHβ基因转录水平.对大鼠垂体 GnRH受体信号转导系统关键分子以及下游重要转录因子分别采用 qPCR与 Western blot方法检测其基因转录与蛋白表达水平.结果 补肾助孕方显著提高了由米非司酮诱导的血清低 FSH 水平与垂体 GnRH 受体低表达(P<0.05),补肾助孕方组高、低剂量组中 PKC、p38MAPK、JNK、ERK、PKA等关键信号转导分子以及 c-Jun、Elk-1、Egr-1、CREB等转录因子的mRNA及蛋白表达均显著高于模型组(P<0.05),但CAM及其下游的Nur77在各组间均无显著差异.结论补肾助孕方能够通过调节垂体 GnRH受体信号转导系统调节垂体促性腺激素的分泌水平,证明该方具有调节生殖轴整体功能的作用,阐释了中医心-肾-子宫轴理论与现代医学下丘脑-垂体-卵巢轴在内容上的一致性.
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GnRH激动剂主动免疫对GnRHR在腺垂体与子宫表达及分布的作用研究
目的 探讨GnRH激动剂主动免疫对绵羊腺垂体与子宫GnRHR表达及分布的影响,为深入研究GnRH-A调节生殖功能的机理及合理应用提供依据.方法 28只5～6月龄健康母绵羊(Ovis aries)随机分为4组(n=7),实验Ⅰ组(EG-Ⅰ)、实验Ⅱ组(EG-Ⅱ)和实验Ⅲ组(EG-Ⅲ)于0d和14 d分别皮下注射阿拉瑞林抗原200 μg、300 μg和400 μg(0d和14d各1次)；对照组(CG)皮下注射2.0 ml药物的溶媒(0d和14 d各1次).各组于70 d无菌切取腺垂体和子宫.提取腺垂体总RNA,实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测GnRHR mRNA表达的变化,Western blotting分析子宫GnRHR蛋白表达,免疫组织化学SP法染色检测GnRHR表达的变化.结果 EG-Ⅰ、EG-Ⅱ和EG-Ⅲ腺垂体GnRHR mRNA表达量均低于对照组,以EG-Ⅲ小(P＜0.01).与CG相比,EG-Ⅰ、EG-Ⅱ和EG-Ⅲ子宫GnRHR蛋白表达水平分别减少3.46％、4.90％和24.78％(P＜0.05).子宫组织中有GnRHR分布主要见于子宫内膜细胞和子宫腺上皮细胞的胞质和胞核,EG-Ⅲ灰度值显著低于CG(P＜0.05).结论 GnRH激动剂主动免疫可以剂量依赖性地抑制垂体GnRHR mRNA和子宫组织中GnRHR蛋白的表达.GnRHR主要分布在子宫内膜上皮细胞和腺上皮细胞的胞核和胞质,GnRHR激动剂免疫对子宫中GnRHR的分布具有抑制作用.
关键词： 促性腺激素释放激素激动剂 GnRH受体 免疫组织化学 子宫 母羊
