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用双向电泳技术探讨益生注射液抗缺血再灌注损伤的分子机制
目的:用双向电泳技术探讨天然成分组方药物益生注射液抗移植物缺血再灌注损伤的分子机制.方法:利用血管内皮细胞缺氧损伤模型模拟移植器官的缺血再灌注损伤过程,通过双向电泳技术观察受损细胞用药修复前后蛋白质组的变化,探索药物作用的靶标及分子机制.结果:发现缺血再灌注损伤可以导致内皮细胞大量蛋白质含量发生变化,但只有8种蛋白质在用药前后含量发生明显改变(其中6种蛋白质在细胞受损后含量下降,益生药物干预后上调;另2种受损后含量增高,药物作用后下调).结论:双向电泳技术为分析药物作用的分子机制提供了新的有效手段,益生注射液可能将血管内皮细胞的8种蛋白质作为靶标,通过调节其含量而发挥抗缺血再灌注(缺氧再给氧)损伤作用.
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缺氧再给氧对内皮细胞免疫功能的影响及益生注射液干预效果初探
目的:探讨缺血再灌注(缺氧再给氧)对内皮细胞免疫功能的影响及益生注射液的干预效果.方法:用人脐静脉内皮细胞株ECV304缺氧再给氧模型模拟体内缺血再灌注对血管内皮细胞的损伤,并用益生注射液干预其缺氧再给氧过程.间接免疫荧光染色显示胞内核因子-κB(NF-κB),流式细胞术检测细胞表面HLA-ABC、HLA-DR、CD86和CD54,并将内皮细胞与同种异体淋巴细胞混合培养(MELR),检测淋巴细胞增殖程度、IL-2的产生及凋亡淋巴细胞百分率.结果:缺氧再给氧使ECV304细胞变圆、收缩、脱落,胞浆NF-κB表达增高,且由胞浆阳性为主转为胞核阳性为主,细胞表面HLA-ABC、HLA-DR、CD86增高,CD54无显著变化,MELR中3H-TdR掺入量、IL-2生成量显著增多,凋亡淋巴细胞百分率降低.益生注射液干预后ECV304细胞形态基本恢复正常,NF-κB表达未下调,但核阳性细胞百分率降低,以核浆阳性为主,其他多项检测指标的改变得以逆转.结论:缺氧再给氧影响了ECV304细胞几种重要免疫相关分子的表达,益生注射液可发挥拮抗作用,使内皮细胞保持相对正常的免疫学功能.
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益生注射液对猪同种异基因肾移植早期干预效果的实验研究
选择组织相容性较好的10对互为供受体的川白猪行同种异基因单肾移植,每两头配对的被随机分配至益生干预实验组和对照组.实验组在供肾灌洗保存液中加500 μg/ml益生注射液,并于术后1周静注益生注射液12 mg/(kg·d).术后监测移植肾功能,并于术后不同时间作移植肾病理检查、组织匀浆超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量测定.发现实验组移植肾慢性病变较对照组轻,功能较好,血清肌酐和尿素氮值始终低于对照组同时间点水平,且SOD含量较对照组高,而MDA含量较对照组低.认为益生注射液于供肾离体即行早期干预,可改善因缺血再灌注损伤所致的移植肾急、慢性病变.
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益生注射液对大鼠移植肺缺血再灌注损伤的保护作用
将40只大鼠随机分成实验组和对照组,各10对,建立左肺移植模型.实验组应用益生注射液+低钾右旋糖酐液(LPD液)、对照组单纯应用LPD液为移植肺再灌注液和保存液.检测两组再灌注开始后各时点左肺静脉血氧分压,再灌注2 h后超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平及肺湿、干重比(W/D),并行术后受体左肺病理检查.结果 :左肺静脉血氧分压各时点实验组均高于对照组(P<0.05);再灌注2 h后SOD水平实验组较对照组高,MDA水平及W/D值实验组较对照组低(P<0.05);光镜下实验组移植肺较对照组病变程度轻.认为益生注射液能减轻大鼠移植肺早期缺血再灌注损伤(IRI),其保护作用机制可能与增加SOD水平,清除氧自由基、减轻脂质过氧化反应及炎症反应有关.
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益生注射液对缺血再灌注损伤睾丸的保护作用
目的:探讨益生注射液抗睾丸缺血再灌注损伤作用.方法:建立人尸睾丸离体缺血再灌注损伤模型,用益生注射液干预后,观察睾丸形态,并以DNA原位缺口末端标记(TUNEL)技术显示生精细胞凋亡,NADPHd法显示一氧氮合酶(NOS)活性,硝酸盐还原酶法测定组织匀浆一氧化氮(NO)含量.结果:缺血再灌注使睾丸组织结构破坏,生精细胞凋亡指数增高,一氧化氮合酶活性增强,一氧化氮合成增多(与正常对照相比,P分别小于0.01,0.05,和0.01);益生注射液明显改善了睾丸组织形态,并使细胞凋亡指数、一氧化氮合酶活性及一氧化氮生成量显著下降(与正常对照组织相比,P均大于0.05).结论:提示益生注射液可保持睾丸组织中NO的正常含量,从而具有抗睾丸缺血再灌注损伤的作用.
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益生注射液抗大鼠离体心脏冷缺血损伤的实验研究
目的:探讨中药益生注射液对大鼠离体心脏冷缺血损伤的保护作用,为临床应用提供部分实验依据.方法:采用雌性封闭群SD大鼠18只,分两组,对照组的离体心脏用4℃生理盐水保存,实验组的离体心脏则用含益生注射液的4℃生理盐水保存,分别于冷藏2、6、12、24、48和72h取材作酶组织化学检查.结果:对照组,冷藏24h,碱性磷酸酶(ALP)、辅酶Ⅱ黄递酶(NADPHD)活性开始下降;冷藏48h后,乳酸脱氢酶(LDH)活性开始下降,ALP和NADPHD活性明显下降;冷藏72h后,琥珀酸脱氢酶(SDH)和细胞色素氧化酶(CCO)活性开始下降,NADPHD活性几乎完全丧失;实验组,冷藏24h、48h和72h,NAD-PHD、LDH和CCO活性分别开始下降,但不如对照组明显;冷藏48h后,ALP活性才开始下降;冷藏72h,SDH活性无变化.结论:冷缺血可引起离体心肌损伤,其中血管内皮细胞对冷缺血损伤敏感,益生注射液对离体心肌冷缺血损伤具有保护作用.
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益生注射液抗大鼠移植心慢性失功加快模型的实验研究
目的:探讨中药益生注射液对大鼠移植心慢性失功(Chronic graft failure,CGF)加快模型的保护作用,为临床应用提供部分实验依据.方法:采用雌性封闭群SD大鼠40只,随机分2组,对照组的离体心脏用4℃生理盐水保存3h后,行心脏移植,术后不给任何药物处理,实验组的离体心脏则用含益生注射液的4℃生理盐水保存3 h后,行心脏移植,术后每天腹腔注射益生注射液,剂量为8mg/(kg·d),连续9 d.分别采集受体术前和术后1、3、5、7、9d血液,检测丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)含量变化.另外,在移植术后12周,取2组移植心脏的组织学标本进行比较分析.结果:对照组和实验组心脏移植术后血浆MDA含量显著升高,而SOD活性却显著降低,术后第1天下降明显.对照组与实验组相比,术前2组血浆的MDA含量和SOD活性相似;术后第1天,对照组血浆MDA含量升高,并明显高于实验组45.27±6.48与32.78±6.61,P<0.05,而SOD活性下降,并明显低于实验组529.77±46.31与663.33±45.92,P<0.05;此后,2组的血浆MDA含量和SOD活性逐渐恢复到正常,但对照组恢复较慢,术后第9天才接近正常,实验组恢复较快,术后第5天已恢复正常.对2组移植心脏的组织学标本进行比较,移植后12周,实验组与对照组相比,移植心慢性排斥程度明显减轻(2.20±0.40与3.6±0.48,F=100.41,P<0.0001).心肌间质纤维化程度也减轻(1.00±0.32与1.60±0.48,F=21.63,P<0.000 1).结论:在缺血再灌注损伤(Ischemia reperfusion injury,I/R)诱导的CGF加快模型中,益生注射液对移植心的I/R损伤有保护作用,并能减轻其慢性失功的进程.
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离体睾丸缺血再灌注损伤的实验研究
目的探讨人离体睾丸缺血再灌注损伤的变化规律,了解益生注射液对其变化的干预效果.方法采用13人捐赠尸睾丸26只,用4℃250 ml高渗枸橼酸盐嘌呤液冷保存,再以此液500 ml再灌注.实验组用含500 μg/ml益生注射液同法操作,同一睾丸于单纯冷保存(对照组睾丸8只,实验组8只)6、12、18、24、36、48、60和72小时连续取材,冷保存6、12、18、24和36小时(对照组与实验组每时间点各1只,共10只)后,37℃复温再灌注6和12小时连续取材,作组织学及酶组织化学染色. 结果实验组睾丸组织4℃冷保存24小时内无明显病理改变;36和48小时后出现精索血管内皮细胞肿胀、变性及部分脱落,曲细精管与生精上皮剥离,间质轻度水肿等损伤;冷保存12小时乳酸脱氢酶与琥珀酸脱氢酶活性增高,24小时后又降低;一氧化氮合成酶活性于冷保存18小时后降低再灌注后组织损伤加重.对照组睾丸单纯冷保存12小时即出现精索血管内皮细胞肿胀、变性,24小时后加重,再灌注后精索血管大量内皮细胞变性脱落,曲细精管基膜剥离和间质水肿严重.结论 4℃冷保存24小时内仅有内皮细胞轻微损伤,超过24小时可引起睾丸血管及组织形态结构明显异常,37℃复温再灌注使损伤程度加重;益生注射液使人离体睾丸在4℃冷保存24小时内保持正常形态结构,且对再灌注损伤有保护作用.
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益生注射液抗大鼠腹主动脉移植硬化的实验研究
目的:探讨不同浓度益生注射液A、B两种组分及联合用药对移植物慢性失功(CAD)的防治效果及作用环节.方法:利用组织形态观察;计算机图象分析;过氧化脂质测定和免疫组织化学分析大鼠腹主动脉移植硬化加快模型.结果:术后6周A+B及骁悉(MMF)治疗组能显著抑制血管内膜的增厚,B(10 mg.kg-1)、B(1 mg.kg-1)、A+B组术后各期过氧化脂质(LPO)与术前比无明显差异,各组TGF-β1表达高峰在术后2周,空白对照组各时间点的表达强,A+B及MMF组表达弱.结论:A组分通过抑制T、B淋巴细胞及巨噬细胞增殖、浸润,间接下调TGF-β1的表达,B组分对氧自由基引起的损伤有明显保护作用,A+B有协同作用,其作用与MMF单用相当.
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益生注射液对肾脏热缺血再灌注氧化应激损伤的作用研究
目的观察益生注射液(YM)能否减轻小鼠肾脏热缺血再灌注(I/R)损伤.方法 C57BL/6小鼠肾脏热缺血50 min,再灌注24 h取血和组织.术前12 h和30 min分别腹腔给予不同剂量的YM.观察YM对I/R引起的氧化应激、炎症介质的影响.结果 I/R导致小鼠肾脏严重损伤.给予YM (5、15、25 mg/kg),肾脏丙二醛(MDA)水平分别降低16.6%、25.0%和35.5%,超氧化物歧化酶(SOD)活性分别增加约38.7%、48.3%和76.1%.YM (25 mg/kg)可明显抑制ICAM-1的表达上调.结论 YM至少部分通过降低活性氧的产生、减少粘附分子的表达来减轻小鼠肾脏I/R损伤.
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益生注射液抗移植肾缺血再灌注损伤的疗效及机理探讨
目的探讨益生注射液抗器官移植过程中缺血再灌注损伤的疗效及机理.方法按组织配型结果将动物分成自体肾移植组和同种异体肾移植组,自体和同种异体肾移植组动物又再分为益生液组(给予益生注射液)和对照组(不给予益生注射液),检测益生液组和对照组肾移植术前后肝、肾功能及血清中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的含量.结果移植前后,自体和同种异体肾移植组受体血清总胆红素和丙氨酸氨基转移酶均在正常范围内,益生液组和对照组无显著差异(P>0.05).益生液组术后血清中MDA含量升高幅度明显低于对照组(P<0.05),且SOD反应性增高水平明显高于对照组(P<0.05).结论①益生注射液可能有增强SOD活性、减轻脂质过氧化作用,从而发挥其抗缺血再灌注损伤(IRI)作用.②初步认为益生注射液无明显肝脏毒性,可望作为抗IRI的有效药物.
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益生注射液对人内皮细胞缺氧再给氧损伤的拮抗机理研究
目的探讨内皮细胞缺血再灌注损伤及中药益生注射液对其的拮抗机理.方法用无糖培养基在无氧条件下培养使人脐静脉内皮细胞株ECV304缺氧1.5小时,然后以含糖培养基,在5%CO2和37℃条件下给氧培养5小时,建立内皮细胞缺氧再给氧模型,以模拟体内缺血再灌注对血管内皮细胞的损伤,并用益生注射液干预其缺氧再给氧过程,荧光染色显示胞内钙离子与线粒体,细胞化学染色显示胞内琥珀酸脱氢酶(SDH)和乳酸脱氢酶(LDH)活性,并检测细胞培养液中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)浓度.结果缺氧再给氧使ECV304细胞变圆、收缩、脱落,细胞内钙离子含量增高,线粒体膜电位减弱,SDH活性下降,LDH活性增高,培养液中SOD与NO含量减少,而MDA浓度增高;用益生注射液干预后,ECV304细胞形态基本恢复正常,上述多项检测指标的改变得以逆转.结论缺氧再给氧导致ECV304细胞发生脂质过氧化,胞内钙离子超载、SOD活性及NO水平降低、线粒体功能受损,益生注射液可使上述变化得以逆转,从而拮抗内皮细胞缺氧再给氧损伤.
