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特征图谱法测定蟾皮药材中沙蟾毒精等4种活性成分的含量
目的:采用特征图谱法对不同产地的蟾皮药材进行了分析,并建立了同时测定沙蟾毒精等4种蟾毒配基类成分的含量的方法,为其质量控制和药材鉴定提供依据.方法:采用特征图谱法对不同产地的多批蟾皮药材进行了沙蟾毒精等4种蟾毒配基类成分的含量测定.采用菲罗门Phenomenex Gemini色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相乙腈(A)-水(B)梯度洗脱(0～30 min,10％ ～45％ A;30 ～45 min,45％～ 60％A),流速1.0 mL· min-1,柱温35℃,检测波长296 nm.结果:四川产地蟾皮的沙蟾毒精含量较高(大花皮、中黑皮、超大皮、棕褐色皮、小黑皮质量分数分别是0.252 4％,0.158 4％,0.181 1％,0.125 8％,0.108 8％),其次是江苏产地的黑皮(0.227 5％).四川大花皮中华蟾毒它灵含量较高(0.214 3％),其次是江苏黑皮(0.147 8％).四川小黑皮中蟾毒灵(0.051 0％)和山东小花皮中华蟾酥毒基(0.136 1％)含量较其他产地和品种中较高.总体来说,四川产地的蟾皮4种配基类含量较高,尤其是四川大花皮品种.结论:该文采用特征图谱法对不同产地蟾皮中沙蟾毒精进行了测定,并对其他3种蟾毒配基类成分进行了标定,该方法准确可靠,可用于蟾皮的鉴别和质量控制.不同产地和品种蟾皮中4种蟾毒配基类成分含量不尽相同.
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沙蟾毒精抑制血管生成的作用
探讨沙蟾毒精(arenobufagin)对体内外血管生成的抑制作用.采用MTT法检测沙蟾毒精对人鼻咽癌细胞(CNE-2)、人喉癌细胞(Hep2)、人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)、人结肠癌细胞(LOVO)、人前列腺癌细胞(PC-3及DU145)和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的细胞毒性及运用光学显微镜观察细胞形态的变化,发现沙蟾毒精剂量依赖性抑制CNE-2、Hep2、SH-SY5Y、LOVO、PC-3、DU145和HUVECs增殖,且在对人癌细胞亚细胞毒浓度下能够有效抑制HUVECs的增殖.采用鸡胚尿囊膜(chick embryo chorioallantoic membrane,CAM)模型观察新生血管的生成,结果发现沙蟾毒精作用24 h后,尿囊膜新生血管生成明显减少.采用细胞周期分析法观察到沙蟾毒精阻滞HUVECs于G<,2>/M期,且随着浓度增加,细胞出现sub-G<,1>凋亡峰.运用流式细胞术检测沙蟾毒精作用HUVECs后的凋亡现象以及线粒体膜电位的变化,确证沙蟾毒精呈时间和剂量依赖性诱导HUVECs凋亡,同时检测到线粒体膜电位下降.Western blotting检测发现,沙蟾毒精作用HUVECs后,凋亡标志分子PARP被切割.上述研究表明,沙蟾毒精具有明显的体内外抑制血管生成作用,其抑制作用可能与诱导血管内皮细胞周期阻滞及凋亡有关.
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HPLC-MS法同时测定六神丸中9种蟾蜍二烯内酯类化合物
目的 建立HPLC-MS法同时测定六神丸中9种蟾蜍二烯内酯类化合物(和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基)的方法.方法 采用ODS-2(250 mm× 4.6mm,5μm)色谱柱,以乙腈-0.15％磷酸水溶液为流动相,梯度洗脱,体积流量1 mL/min,柱温40℃,检测波长296 nm.HPLC-MS联用的色谱条件与HPLC分离基本条件一致,流动相为乙腈-0.2％甲酸水溶液.通过电喷雾离子源,正离子模式扫描,对六神丸中9种蟾蜍二烯内酯类化合物进行分析鉴别.结果 9种蟾蜍二烯内酯类化合物均得到良好分离,线性关系良好(r≥0.999 6).加样回收率均在92％～105％,RSD＜5％.应用建立的HPLC-MS方法测定了10批六神丸中9种蟾蜍二烯内酯类化合物的量,分别为和蟾蜍他灵0.40～0.88 mg/g,沙蟾毒精0.32～0.83 mg/g,远华蟾毒精0.61～2.11 mg/g,去乙酰华蟾毒它灵0.15～0.32 mg/g,蟾毒它灵0.84～1.85 mg/g,华蟾毒它灵25.76～62.14 mg/g,蟾毒灵0.96～2.06 mg/g,华蟾酥毒基2.30～4.75 mg/g,脂蟾毒配基1.20～2.61 mg/g.结论 所建立的定量测定方法简便、快速、准确可靠,专属性强,可用于六神丸的质量控制.
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蟾酥干燥炮制前后化学成分和药效学变化考察
目的 考察蟾酥Bufonis venenum鲜浆干燥炮制加工(日晒干燥、50℃真空干燥、50℃鼓风干燥、80℃鼓风干燥、冷冻干燥)前后化学成分及药效变化.方法 HPLC法和TLC法研究蟾酥不同干燥方式炮制前后化学成分的变化,MTT法测试不同炮制干燥品抑制5种不同肿瘤细胞株增殖的效果.结果 5种不同加工炮制方法所得蟾酥,性状有较大差异;化学成分的种类及含量没有明显差异;华蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量之和都符合《中国药典》2015年版标准,大于6％;50℃和80℃鼓风干燥所得蟾酥具有比其他干燥方法更强的肿瘤细胞抑制效果.结论 日晒及50℃鼓风干燥法所得蟾酥符合《中国药典》要求的外观性状.真空干燥和冷冻干燥虽然颜色不符合《中国药典》的规定,但主要有效成分并未发生较大变化.
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基于血清蛋白的沙蟾毒精与盐酸维拉帕米相互作用研究
目的：研究沙蟾毒精和盐酸维拉帕米与血清蛋白的结合及两者间的相互影响。方法：采用平衡透析法和高效液相色谱法测定两种药物与小牛血清蛋白的结合率。荧光光谱法研究沙蟾毒精与牛血清白蛋白和人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)的相互作用，并采用分子对接模拟药物相互作用模式。结果：0.1μg/mL沙蟾毒精与小牛血清蛋白结合率为(61.1±0.2)％，加入不同浓度盐酸维拉帕米后，沙蟾毒精的血清蛋白结合率显著下降，从(61.1±0.2)％下降到(36.9±3.4)％。测得盐酸维拉帕米(2μg/mL)的血清蛋白结合率为(87.5±0.5)％；当加入不同浓度沙蟾毒精后，盐酸维拉帕米血清蛋白结合率无显著变化。荧光光谱检测表明盐酸维拉帕米能够抑制沙蟾毒精与血清白蛋白的结合。分子对接结果表明，沙蟾毒精、盐酸维拉帕米竞争性结合HSA的位点Ⅰ，盐酸维拉帕米与位点Ⅰ的分子结合能力大于沙蟾毒精，置换沙蟾毒精与HSA在位点Ⅰ的结合。结论：盐酸维拉帕米能够抑制沙蟾毒精与血清蛋白及白蛋白的结合。
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沙蟾毒精诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡及其机制的研究
目的 观察沙蟾毒精诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的作用.方法 用MTT法观察沙蟾毒精对人肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响;通过荧光染色、流式细胞分析等方法观察沙蟾毒精对细胞凋亡的影响;RT-PCR和Western blot分析沙蟾毒精对Bcl-2、Bax、p53和p21等基因和蛋白表达的影响.结果 沙蟾毒精对人肝癌SMMC-7721细胞的生长有明显的抑制作用,24 h半数抑制剂量(IC50)为0.415 μg/mL.细胞周期结果显示,人肝癌SMMC-7721细胞经不同浓度的沙蟾毒精处理后,G2/M期细胞数量增加,而G0/G1期细胞数明显减少.RT-PCR和Western blot结果显示,人肝癌SMMC-7721细胞经沙蟾毒精处理后,Bax的表达升高,而bcl-2的表达降低(P＜0.05).结论 沙蟾毒精可能通过线粒体凋亡途径诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡.
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沙蟾毒精与牛血清蛋白的结合及分子对接研究
目的:研究沙蟾毒精(arenobufagin)与牛血清蛋白的相互作用.方法:采用平衡透析法,高效液相色谱测定沙蟾毒精与小牛血清蛋白的结合率.荧光光谱法研究药物与牛血清白蛋白( BSA)的相互作用.采用同源建模和分子对接技术分析药物相互作用模式.结果:沙蟾毒精(1μg·mL-1)与小牛血清蛋白的佳平衡透析时间为30 h,血清蛋白结合率为(57.9±0.7)％,荧光光谱测得沙蟾毒精与BSA的结合常数为1.02×103 L·moL-1.BSA同源建模和分子对接结果显示:沙蟾毒精能够结合到BSA的Site I.结论:沙蟾毒精与小牛血清发生中等强度的结合,白蛋白是沙蟾毒精的载药蛋白.
