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白花蛇舌草总黄酮对黑色素瘤A375和B16细胞增殖抑制作用的研究
目的 观察白花蛇舌草总黄酮(FOD)对体外培养黑色素瘤A375和B16细胞增殖的影响.方法 体外培养黑色素瘤A375和B16细胞,分别使用浓度为6.25、12.5、25、50、100 mg·L-1的FOD作用24、48 h,通过MTT比色法检测细胞生长的抑制作用.结果 12.5 mg·L-1的FOD作用A375细胞48 h后,细胞增殖能力明显受抑制(P＜0.05),25 mg·L-1的FOD作用A375细胞24 h后,细胞增殖能力也明显受抑制(P＜0.05);25 mg·L-1的FOD作用B16细胞48 h后,细胞增殖活力明显下降(P＜0.05),50 mg·L-1的FOD作用B16细胞24 h后,细胞增殖活力也明显降低(P＜0.05);分别作用24 h和48 h后,两组随着浓度的升高,不同浓度对细胞的增殖能力抑制差异有统计学意义(P＜0.05);随着浓度的增高和作用时间的延长,细胞的增殖能力随着下降.结论 FOD能有效抑制黑色素瘤A375和B16细胞增殖,且具有一定的时-效和量-效关系.
关键词： 白花蛇舌草总黄酮 黑色素瘤A375细胞 黑色素瘤B16细胞 生长抑制 -
太空环境诱变黑色素瘤细胞的实验研究
目的观察太空环境对B16细胞生物学特性的影响,寻找免疫原性增强的细胞株.方法将小鼠黑色素瘤B16细胞搭载于第20颗返回式卫星,返地后单克隆化,选择1株形态变异的单克隆细胞株(1#),MTT法检测细胞增殖情况,接种C57BL/6J小鼠,分别观察细胞致瘤性、荷瘤小鼠免疫器官、生存期及瘤体病理变化.结果1#太空诱变细胞株,形态呈现树突状,增殖速率与对照细胞比较差异无统计学意义(P＞0.05),接种C57BL/6J小鼠,肿瘤潜伏期延长(P＜0.01),瘤体重量减小(P＜0.01),胸腺系数增大(P＜0.01),且荷瘤小鼠生存期延长(P＜0.01),而脾系数与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05),病理学结果显示:1#细胞组瘤体内血管不及对照组丰富,坏死区较少,瘤体内浸润淋巴细胞较对照组有不同程度的增多,瘤旁组织内有较多淋巴细胞.结论空间诱变1#细胞株可能趋向分化,体内实验结果提示:1#诱变细胞株抗原性可能被增强,激发了小鼠的免疫应答,该结果为进一步筛选免疫原性增强的细胞株,确定抗原的强化特征提供了实验基础.
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黑色素瘤细胞经太空环境诱变后致瘤性和基因表达变化
目的 筛选经太空环境诱变后B16细胞致瘤性改变的细胞株,观察其基因表达的改变,寻找与黑色素瘤发生及转移密切相关的基因.方法 将小鼠黑色素瘤B16细胞搭载于第20颗返回式卫星,返地后克隆化,随机选择5株克隆细胞株(1#、5#、6#、7#和8#),接种C57BL/6J小鼠,分别观察细胞致瘤性、荷瘤小鼠生存期及瘤体病理变化,用基因表达谱分析其中2株初筛致瘤性改变细胞株(1#和8#)的基因表达情况.结果 与对照组比较,1#细胞株接种小鼠后,肿瘤潜伏期延长(P＜0.05),1#和8#细胞株移植瘤瘤体重量减小(P＜0.01),且荷瘤小鼠生存期延长(P＜0.01);病理诊断结果显示:1#和8#细胞移植瘤内血管不及对照组丰富,坏死区较少,瘤体内浸润淋巴细胞较对照组有不同程度的增多,瘤旁组织内有较多淋巴细胞;基因芯片分析结果表明:与对照B16细胞相比,2株诱变细胞(1#和8#)分别有145和125个基因表达水平发生改变(P＜0.05),其中9个基因为共同变化基因,前列腺素D2合成酶基因在2株细胞中的表达均明显增高,与对照相比,差别在5倍以上.结论 1#和8#细胞株致瘤性减弱,且2株细胞的移植瘤肿瘤新生血管及癌旁浸润减少,癌旁组织中有较多淋巴细胞,推测可能与前列腺素D2合成酶等多种肿瘤相关基因表达的改变有关.
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老瓜头生物总碱抑制小鼠黑色素瘤B16细胞增殖及促凋亡作用的研究
目的 研究老瓜头生物总碱对小鼠黑色素瘤B16细胞的增殖抑制与促进凋亡的作用.方法 采用小鼠黑色素瘤B16细胞,MTT法检测老瓜头生物总碱对B16细胞增殖的抑制作用,通过琼脂糖凝胶电泳、Hoechst 33258染色、Caspase-3和Caspase-8活性检测,观察老瓜头生物总碱诱导细胞凋亡的作用和机制.结果 MTT检测显示老瓜头生物总碱抑制B16细胞的增殖,呈现时间依赖性和浓度依赖性,作用24、48、72 h的IC50分别为0.97、0.98、0.16 mg·L-1;选用浓度0.25、0.5、1mg·L-1老瓜头生物总碱孵育B16细胞24 h,经DNA Ladder检测出现阶梯状DNA Ladder,片段100～200 bp,呈现细胞凋亡裂解;0.5、1 mg·L-1老瓜头生物总碱孵育B16细胞24h后Rhodamine 123染色与空白对照组相比显示荧光降低,且随浓度增加,荧光降低增加;凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-8活性增强,0.5、1 mg ·L-1老瓜头生物总碱药物组与对照组相比有显著性差异(P ＜0.05,P＜0.01).结论 老瓜头生物总碱可抑制B16细胞增殖,诱导B16细胞凋亡,可通过增强凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-8活性诱导凋亡.
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异硫氰酸荧光素标记动态观察天花粉蛋白对黑色素瘤B16细胞的损伤
目的:应用异硫氰酸荧光素标记天花粉蛋白,在激光共聚焦显微镜下直接观察天花粉蛋白进入黑色素瘤B16细胞的动态过程并分析其对黑色瘤B16细胞的损伤作用. 方法:实验于2003-08/2004-08在南通大学神经再生重点实验室完成.将常规传代培养的黑色素瘤B16细胞用胰酶消化,以5×109个/L的浓度种植于24孔培养板.将天花粉蛋白、异硫氰酸荧光素-天花粉蛋白、异硫氰酸荧光素-牛血清白蛋白分别加入培养细胞中,终浓度为50 mg/L,同时加入等量生理盐水作为正常对照组,每组再分别设3,6,12 h不同孵育时间组.异硫氰酸荧光素标记天花粉蛋白后,利用激光共聚焦显微镜观察异硫氰酸荧光素-天花粉蛋白进入细胞的过程及其荧光强度,CCK-8细胞毒性实验评估各组细胞存活率、并用单细胞凝胶电泳及hoechst33258染核观察天花粉蛋白对黑色素瘤B16细胞致DNA损伤作用.结果:①终浓度50 mg/L的异硫氰酸荧光素-天花粉蛋白孵育3 h时已经进入黑色素瘤细胞,6 h时进入细胞量达到高,12 h时已轻度下降,各时间点比较差异有统计学意义(P＜0.01).异硫氰酸荧光素-天花粉蛋白组与异硫氰酸荧光素-牛血清白蛋白组荧光强度差异有显著性(P＜0.01).②终浓度50 mg/L异硫氰酸荧光素-天花粉蛋白、天花粉蛋白孵育黑色素瘤细胞3,6 h后利用单细胞电泳和Hoechst33258染色未观察到核形态的变化;但孵育6 h后CCK-8细胞毒性实验显示活细胞数量明显下降;孵育12 h后出现DNA损伤的特征性彗星尾现象,并观察到明显的核浓缩和边集现象,出现特征性凋亡小体.结论:孵育6 h时天花粉蛋白进入细胞量多,但并没有明显的细胞DNA损伤的作用,而孵育12 h时产生明显的细胞毒作用和凋亡的发生.
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三氧化二砷诱导黑色素瘤B16细胞凋亡机制
目的 观察三氧化二砷(As2O3)对黑色素瘤B16细胞(B16细胞)的作用,探讨As2O3抗肿瘤的机制.方法 Hoechst33258染色观察细胞凋亡特征;应用激光扫描共聚焦显微术(LSCM),结合特异性荧光探针Fluo-3/AM、H2DCF-DA和DAF-FM-DA,观察As2O3引起瘤细胞内钙离子(Ca2+)、活性氧(ROS)和一氧化氮(NO)的变化.结果 50 μmol/L As2O3作用细胞12 h后,Hoechst33258核染色可见典型凋亡细胞;细胞内Ca2+、ROS和NO含量明显高于对照组(P＜0.01).结论 As2O3可诱导B16细胞发生凋亡,As2O3诱导凋亡可能与细胞内Ca2+、ROS和NO的增加有关.
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rhIL-24对黑色素瘤B16细胞的体内外抑瘤作用
目的 研究重组人白细胞介素24(rhIL-24)及真核表达基因重组质粒pcDNA3.0-hIL-24对黑色素瘤B16细胞(B16细胞)及其荷瘤小鼠体内外抑肿瘤作用.方法 用rhIL-24蛋白作用于小鼠B16细胞,检测其对B16细胞的生长抑制作用及诱导凋亡作用,并用rhIL-24蛋白及pcD-NA3.0-hIL-24治疗荷瘤小鼠.结果 rhIL-24蛋白对体外培养的B16细胞具有显著的抑制生长和诱导凋亡作用,rhIL-24蛋白及pcDNA3.0-hIL-24对C57/BL6小鼠体内形成的恶性黑色素瘤具有明显的抑瘤作用.结论 rhIL-24蛋白具有生物活性,他及真核表达重组质粒对B16细胞及其小鼠种植瘤生长有抑制作用,并能诱导肿瘤细胞凋亡及促进其分化.
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三羟异黄酮抑制黑色素瘤B16细胞增殖作用的机制研究
目的:研究三羟异黄酮抑制黑色素瘤B16细胞增殖作用的分子机制.方法:以4',5,7三羟异黄酮处理黑色素瘤B16细胞1～4天后,以生长曲线反映其增殖活力,以B16细胞形态、黑色素含量及以流式细胞仪检测细胞周期变化等观察三羟异黄酮对黑色素瘤B16细胞的抑制增殖作用.结果:用10、30、90 μmol/L的三羟异黄酮作用肿瘤细胞均有不同程度的抑瘤作用(P<0.05～P<0.01).表现为黑色素生成能力增加,细胞生长缓慢,可使B16细胞阻断在S期.结论:三羟异黄酮不同剂量对体外黑色素瘤B16细胞增殖有明显的抑制作用.
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三氧化二砷对黑色素瘤B16细胞端粒酶活性影响
目的:研究三氧化二砷(As2O3)对黑色素瘤B16细胞端粒酶活性的作用,探讨砷及其化合物治疗黑色素瘤的作用机制,为其治疗黑色素瘤提供新的理论和实验依据.方法:用TRAP-ELISA和TRAP-PAGE银染法检测黑色素瘤B16细胞(简称B16)端粒酶活性.结果:As2O3对黑色素瘤B16细胞端粒酶活性的抑制有明显的浓度和时间依赖关系.结论:As2O3对黑色素瘤B16细胞端粒酶活性表达的抑制作用随药物浓度的增加或作用时间的延长而增强.
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澳洲茄碱对黑色素瘤细胞的抑制作用
目的：研究澳洲茄碱对小鼠黑色素瘤细胞的抑制作用及其机制。方法：采用MTT法检测了澳洲茄碱对小鼠黑色素瘤B16细胞株的抑制效果；以稍高于半致死剂量的澳洲茄碱处理B16细胞48h后，进行荧光定量PCR，分析药物及其溶媒对B16细胞中p53通路的激活情况。结果：澳洲茄碱对小鼠黑色素瘤B16癌细胞有明显的抑制作用，并呈现剂量和时间依赖性；其48h IC50约为35μg／mL；SYBR绿色荧光定量PCR数据显示，澳洲茄碱的处理显著提高了癌细胞中p53通路的下游因子Puma基因的表达水平（ P﹤0.05）。结论：澳洲茄碱能明显抑制黑色素瘤B16癌细胞的生长，并能显著激活p53通路，这很可能是导致黑色素瘤细胞死亡的主要原因。
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重楼皂苷Ⅱ诱导黑色素瘤B16细胞凋亡的机制研究
目的:研究重楼皂苷Ⅱ诱导黑色素瘤B16细胞凋亡的作用及机制.方法:采用MTT法观察重楼皂苷Ⅱ对B16细胞增殖的抑制作用;采用DAPI染色于倒置荧光显微镜下观察重楼皂苷Ⅱ对B16细胞诱导凋亡的形态学改变;Annexin V-FITC/PI双染及流式细胞术检测重楼皂苷Ⅱ对B16细胞凋亡率的影响;JC-1染色流式细胞仪检测重楼皂苷Ⅱ作用B16细胞后细胞线粒体膜电位的变化;Western blot检测重楼皂苷Ⅱ对B16细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2的表达变化.结果:重楼皂苷Ⅱ对B16细胞的增殖有明显的抑制作用,并呈时间及浓度依赖性;重楼皂苷Ⅱ作用B16细胞后凋亡率随药物浓度的升高而升高;线粒体膜电位水平也随之显著降低,与空白对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01);Western blot检测结果表明Bcl-2蛋白表达水平显著降低.结论:重楼皂苷Ⅱ可能通过线粒体氧化应激通路从而诱导B16细胞凋亡.
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新藤黄酸诱导黑色素瘤B16细胞凋亡的研究
目的:研究新藤黄酸(Gambogenic Acid,GNA)对黑色素瘤B16细胞的增殖抑制作用,并探讨细胞凋亡机制在其中的角色.方法:MTT法检测新藤黄酸对B16细胞生长和增殖的作用;采用acridine orange/ethidium bromide(AO/EB)荧光染色观察新藤黄酸对B16细胞的影响;采用流式细胞仪检测新藤黄酸处理B16细胞后细胞内活性氧(ROS)的产生;Western blotting法检测凋亡相关蛋白Caspase-3的变化.结果:MTT结果表明新藤黄酸在一定浓度下对黑色素瘤B16细胞的增殖有明显抑制作用,并呈一定的时效和量效关系;AO/EB染色观察表明新藤黄酸处理的细胞呈现明显的凋亡状态;新藤黄酸处理细胞后,细胞内活性氧的急剧增加,与未给药组比较有统计学意义(P＜0.01),同时线粒体膜电位也随之下降;Western blotting检测发现新藤黄酸作用后cleaved-Caspase-3蛋白表达量增加.结论:新藤黄酸在一定的时间和浓度范围内能够抑制黑色素瘤B16细胞的增殖,诱导细胞发生凋亡.
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SL7207/PCMV-mtHSP70-IRES-EGFP重组沙门菌的构建及在B16细胞中的表达
目的 构建能够稳定表达结核杆菌热休克蛋白70(mycobacterium tuberculosis heat shock protein 70,mtHSP70)与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)双基因的鼠减毒伤寒沙门菌真核共表达载体,探讨其在小鼠黑色素瘤B16肿瘤细胞中的表达.方法 将重组质粒PCMV- mtHSP70-IRES-EGFP电穿孔转入减毒沙门氏菌SL7207中,酶切鉴定,并对构建的重组减毒沙门氏菌体外连续传代20代后再酶切鉴定,对其稳定性进行观察;重组菌体外感染B16,荧光显微镜下观察B16细胞荧光表达及蛋白印迹法(Western blot)检测重组菌在B16细胞内mtHSP70蛋白的表达.结果 PCMV-mtHSP70-IRES-EGFP成功导入减毒沙门氏菌SL7207中;该重组菌株在体外能稳定地繁殖、生长和传代;重组菌体外感染B16约36 h后,B16细胞胞体变圆并高效表达强荧光,重组菌在B16细胞内表达mtHSP70蛋白.结论 成功构建能在真核细胞中稳定表达mtHSP70与EGFP双基因的重组减毒沙门氏菌株,为恶性黑色素瘤靶向基因免疫治疗的后续研究奠定了基础.
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知母皂苷AⅢ对黑色素瘤B16细胞生长和Bax，Bcl-2 mRNA的影响
目的：观察知母皂苷AⅢ对体外培养黑色素瘤B16细胞增殖和凋亡的影响。方法体外培养B16细胞，分别以浓度为1，2，4，8，16μmol·L-1的知母皂苷AⅢ作用24 h，通过MTT比色法检测对细胞生长的影响；倒置显微镜观察对细胞形态的影响；Annexin V-FITC/PI双染流式检测对细胞凋亡的影响；逆转录PCR检测对细胞凋亡相关基因Bax，Bcl-2的影响。结果8，16μmol·L-1的知母皂苷AⅢ明显抑制细胞增殖，24 h的半数抑制浓度（IC50）为10.16μmol·L-1；细胞形态显示16μmol·L-1的知母皂苷AⅢ使细胞体积缩小变圆，细胞减少。与对照组比较，10μmol·L-1知母皂苷AⅢ细胞凋亡率为（4.83±0.25）%（P<0.01），而Bax/Bcl-2比值升高（P<0.05）。结论体外实验显示知母皂苷AⅢ能明显抑制B16细胞生长，并能诱导部分细胞发生凋亡。由于诱导细胞凋亡率与24 h的IC50有一定差距，因此知母皂苷AⅢ对B16细胞生长的影响可能不仅仅与激活凋亡信号通路有关，还与其他细胞生长信号通路有关。
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云芝多糖对小鼠黑色素瘤B16细胞体外增殖和凋亡的影响及其机制Δ
目的：研究云芝多糖（CVP）对小鼠黑色素瘤B16细胞体外增殖、凋亡的影响及其机制。方法：采用MTT法测定以二甲基亚砜（DMSO，阴性对照）和0（空白对照）、0.156、0.3125、0.625、1.25、2.5、5.0、10.0μg/ml CVP分别培养细胞48、72 h后的细胞存活率，计算半数抑制浓度（IC50）；流式细胞术测定以DMSO（阴性对照）和0（空白对照）、0.5μg/ml CVP分别培养细胞24、48、72 h后的细胞凋亡率；实时荧光定量聚合酶链式反应法测定以DMSO（阴性对照）、0.5μg/ml CVP培养细胞48、72 h后细胞中凋亡相关基因P53、Bcl-2、Fas mRNA的表达。结果：0.156～10.0μg/ml CVP对B16细胞的生长均有抑制作用，并在0.156～0.625μg/ml范围内呈浓度和时间依赖性，培养48、72 h的IC50分别为（0.32±0.01）、（0.18±0.04）μg/ml。0.5μg/ml CVP培养细胞24、48、72 h后，细胞凋亡率较阴性对照和空白对照均明显升高（P＜0.01）；0.5μg/ml CVP培养细胞48、72 h后，细胞中P53、Bcl-2、Fas mRNA表达水平较阴性对照明显降低（P＜0.01）。结论：CVP可抑制小鼠B16细胞的增殖并诱导其凋亡，其机制可能与下调细胞中P53、Bcl-2和Fas基因的表达有关。
