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Mda7/IL-24基因的克隆及其融合蛋白在E.coli中的表达
目的:克隆人黑素瘤分化相关基因(melanoma differentiation associated gene,mda-7/IL-24),并在大肠杆菌中表达.方法:从PHA刺激培养的人外周血淋巴细胞提取总RNA,根据mda-7/IL-24基因序列设计引物,用PCR法扩增mda-7/IL-24基因.将mda-7/IL-24基因插入表达载体pET-28a(+)中,构建表达载体pET-28a-mda-7/IL-24,用IPTG诱导目的蛋白在E.coli中表达.通过Western印迹分析对表达产物进行鉴定.结果:经RT-PCR从人外周血分离的淋巴细胞中扩增到mda-7/IL-24 cDNA,序列分析与文献报道一致;SDS-PAGE分析表明,经0.5 mmol/L IPTG 37℃诱导4 h后在E.coli中有大量mda-7/IL-24融合蛋白表达,相对分子质量约为28×103,融合蛋白约占诱导菌总蛋白的30%;Western印迹分析提示,诱导表达产物能与His单抗发生特异性反应.结论:从人外周血淋巴细胞中获得了mda-7/IL-24的全长cDNA,融合蛋白在E.coli中获得高效表达.
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人白细胞介素24 mRNA在瘢痕疙瘩中的表达及意义
目的:从基因水平测量瘢痕疙瘩组织中白细胞介素24的表达水平,探讨白细胞介素24在瘢痕疙瘩发生、发展过程中的作用和意义.方法:实验于2005-10/2006-09在广东医学院整形外科研究所完成.①选取2004-06/2005-10广东医学院附属医院整形外科收治的患者,瘢痕疙瘩标本12例,正常瘢痕标本10例,行巨乳缩小、除皱术、植皮等患者正常皮肤标本12例,患者均知情同意且自愿捐献标本,实验经医学伦理委员会批准.标本取材部位为颜面、前胸、四肢等,切取后液氮保存.②低温条件下切取秤量组织,采用Trizol法提取总RNA.电泳鉴定总RNA完整性,并统一调整总RNA含量为10 g/L,-70 ℃储存.RT-PCR二步法合成cDNA.③以正常皮肤、正常瘢痕为对照,以GAPDH作为扩增内参照基因,将正常皮肤、正常瘢痕和瘢痕疙瘩各类标本总RNA反转录的cDNA模板浓度调整相对一致进行扩增反应.以白细胞介素24 mRNA与GAPDH mRNA的光密度积分值之比作为各类组织标本中白细胞介素24的相对含量,比较白细胞介素24 mRNA在正常皮肤、正常瘢痕及瘢痕疙瘩组织中的表达情况.结果:①各类组织标本中总RNA抽提结果:正常皮肤、正常瘢痕和瘢痕疙瘩组织中抽提总RNA经甲醛变性凝胶电泳后显示较清晰的18 s和28 s条带,经紫外分光光度计测定A260/A280≈2.0.②各类组织标本中白细胞介素24 mRNA的表达:白细胞介素24和GAPDH基因表达产物通过RT-PCR方法得到的特异性DNA片段长度分别为173 bp和577 bp.瘢痕疙瘩的白细胞介素24 mRNA与GAPDH mRNA的吸光度比值明显低于正常皮肤、正常瘢痕(0.577±0.113,1.070±0.185,1.139±0.195;t=7.436×10-8～4.745×10-8,P均＜0.01),正常皮肤与正常瘢痕白细胞介素24 mRNA的相对表达量基本一致(t=0.405,P＞0.05).结论:瘢痕疙瘩的形成可能与白细胞介素24在组织中的表达降低有关.提示采用基因疗法提高早期瘢痕疙瘩中白细胞介素24的含量与活性,可能为瘢痕疙瘩的康复治疗提供有效途径.
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rhIL-24对黑色素瘤B16细胞的体内外抑瘤作用
目的 研究重组人白细胞介素24(rhIL-24)及真核表达基因重组质粒pcDNA3.0-hIL-24对黑色素瘤B16细胞(B16细胞)及其荷瘤小鼠体内外抑肿瘤作用.方法 用rhIL-24蛋白作用于小鼠B16细胞,检测其对B16细胞的生长抑制作用及诱导凋亡作用,并用rhIL-24蛋白及pcD-NA3.0-hIL-24治疗荷瘤小鼠.结果 rhIL-24蛋白对体外培养的B16细胞具有显著的抑制生长和诱导凋亡作用,rhIL-24蛋白及pcDNA3.0-hIL-24对C57/BL6小鼠体内形成的恶性黑色素瘤具有明显的抑瘤作用.结论 rhIL-24蛋白具有生物活性,他及真核表达重组质粒对B16细胞及其小鼠种植瘤生长有抑制作用,并能诱导肿瘤细胞凋亡及促进其分化.
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人白介素24基因诱导人宫颈癌Ca Ski细胞凋亡的实验研究
目的:研究人白介素24(hIL-24)在体外诱导宫颈癌Ca Ski细胞凋亡及其作用机制.方法:①以脂质体包裹重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-hIL-24转染Ca Ski细胞; ②利用RT-PCR技术检测处理后Ca Ski细胞中HPV E6癌基因的mRNA水平变化; ③ Western Blot分析处理后Ca Ski细胞中抑癌蛋白P53水平的变化; ④流式细胞仪分析处理后的Ca Ski细胞凋亡情况.结果:处理后Ca Ski细胞中HPV E6癌基因的mRNA水平下降,抑癌蛋白P53水平增加,细胞凋亡率升高.结论:真核表达载体介导的hIL-24基因体外转染宫颈癌Ca Ski细胞后,能抑制Ca Ski细胞中HPV E6癌基因的表达,使抑癌蛋白P53恢复活性,促使宫颈癌Ca Ski细胞凋亡.
