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昆明地区22株人轮状病毒VP7及NSP4基因分析
目的研究昆明地区轮状病毒(RV)不同VP7血清型及NSP4基因变异与腹泻的流行及症状严重程度的关系.方法对2002年和2003年分离于昆明地区的RV,用PCR分型法对四种主要的VP7血清型进行分型,并对从150份RV腹泻标本VP7血清型为G1、G3、G4型RV株中挑出的14份一般腹泻株和8份重症腹泻株的NSP4基因序列进行了分析,与来自GenBank Database的4株人RV(Wa、KUN、AU-1、Hochi)和3株动物RV(EW、OSU、SA11)以及中国不同地区流行株NSP4的基因变异情况进行了比较.结果2002年昆明地区RV流行株以G1型为主,2003年RV腹泻株以G3型为主;昆明地区RV流行株间的氨基酸同源性高达98.9%～99.4%,22株流行株全都属于Wa组;NSP4变异与地域及VP7血清型无关;NSP4基因变异与RV腹泻临床症状严重程度不相关(P＞0.05).结论不同年份相同季节不同地域流行的RV VP7血清型变异较大,而NSP4基因的相对保守性及其免疫原性使其有可能成为发展疫苗的候选基因.
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G9型人A组轮状病毒LL52696与LL52727株的主要基因及其编码蛋白特征的分析
人A组轮状病毒(Human rotavirus,HRV)是引起世界范围婴幼儿重症腹泻的主要病原,也是导致发展中国家婴幼儿死亡的主要病因之一[1-3],世界卫生组织统计每年大约引起611 000婴儿和儿童死亡,特别是发展中国家[4].HRV感染广泛,且改善营养状况和卫生条件对HRV发病危险影响不大,因此在发达国家和发展中国家HRV感染率接近.HRV引起的腹泻至今无特效药,发展疫苗对控制HRV感染的作用就显得特别突出.
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引起产科新生儿腹泻暴发的轮状病毒株VP4 VP7编码基因与其毒力关系的探讨
克隆并测定了引起产科新生儿腹泻暴发的P2[6]、G4型轮状病毒(BN株)VP4的VP8片段和VP7编码基因的核苷酸序列,并据此推导出其氨基酸序列.与相应标准株和地方株(包括有毒株和无毒株)比较的结果表明,所测VP8序列与相同型别(P2[6])的标准株M37(无毒株)和ST3(无毒株)、地方株N16(无毒株)和VE7156(有毒株)之间的同源性为92.8%～98.6%,胰酶作用位点各毒株间相同;位于aa49、aa50、aa52、aa53、aa78处的氨基酸在有毒株与无毒株间(包括BN株)不同,但分别保守.VP7基因与同型(G4)标准株ST3(A亚型/无毒株)和VA70(B亚型/有毒株)、意大利地方株PV5249(A亚型/有毒株)和北京地方株CR117(有毒株)、同型猪有毒株Gott之间的同源性为91.4%～97.8%,其中与A亚型的同源性为95.5%～96.3%,而与B亚型的同源性为91.4%,提示VP7为G4A亚型,位于aa38、aa78、aa145、aa238位点的氨基酸在有毒株与无毒株之间不同,但分别保守.分析了虽为P2[6]型却反常地引起新生儿腹泻暴发毒株(BN)的VP8与VP7基因的变异情况,并对轮状病毒毒力与VP4、VP7基因变异的相互关系进行了讨论,为慎重确定轮状病毒疫苗候选毒株提供理论依据.
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宁波市一起新生儿轮状病毒腹泻爆发的调查
目的 了解宁波市轮状病毒(Rotavirus,RV)地方株的基因型,为中国轮状病毒疫苗的研制提供资料.方法 通过逆转录-聚合酶链反应获得宁波市RV流行株VP7基因全序列并进行序列测定.结果 Ningbo 06-1和Ningbo 06-3 VP7氨基酸同源性为90.2%,且均与G1型的标准株Wa同源性较高,分别为95.1%和87.7%,而与其它血清型代表株同源性均<85%.在VR5和VR8两个高变区域,Ningbo 06-1和Ningbo 06-3与Wa的同源性分别为89.3%和75.0%,与其它血清型代表株同源性分别低于67.9%和60.7%.结论 宁波市A组RV以G1血清型第一亚组为主.
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中国部分城市A组轮状病毒感染状况调查及VP7血清型分析
目的研究我国A组轮状病毒感染状况及VP7血清型分布。方法利用PAGE电泳检测北京、沈阳、新乡、上海、深圳、广州六个城市1997和(或)1998年秋冬季婴幼儿腹泻A组轮状病毒的感染状况，并采用RT-PCR方法对4种主要的VP7血清型(G1、G2、G3和C4型)进行分型。结果 374份标本中有181份为轮状病毒阳性，检出率48.4％。各地标本的检出率在32％～63％之间，北京、上海地区两年的检出率基本近似。阳性标本经PCR分型方法鉴定G1、G2、G3和G4型的感染率分别为89.5％、6.1％、2.8％和0。有两例为G1和G2型混合感染，另有1例经测序证实为G9型。各地之间、每年之间RV的流行状况略有差异。结论 G1、G2和G3型是我国A组轮状病毒感染的主要血清型。
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腺病毒载体表达轮状病毒G1型外壳蛋白VP7及其诱导的免疫应答研究
构建表达地方流行株轮状病毒G1型外壳蛋白VP7的复制缺陷型重组腺病毒,免疫小鼠评价其体液及细胞免疫反应效果,探讨基因工程轮状病毒疫苗的实验基础及可行性.RT-PCR扩增轮状病毒VP7基因并克隆至pshuttle-CMV穿梭质粒,pshuttle-VP7与腺病毒骨架质粒同源重组后转染293细胞包装重组腺病毒rAd-VP7.RT PCR、western blot检测rAd-VP7在体外细胞中的转录及表达.rAd-VP7经肌注或滴鼻免疫小鼠后检测其血清IgG、肠道IgA及中和抗体效价;流式、ELISPOT检测淋巴细胞亚群变化及IFN-γ分泌情况.结果显示ELISA可检测到免疫小鼠血清IgG和滴鼻组肠道IgA抗体的产生;肌注和滴鼻免疫组中和抗体平均滴度分别为228和322.5;免疫小鼠脾细胞IFN-γ的分泌增加.表达轮状病毒VP7的重组腺病毒不但能够激发体液及细胞免疫反应,滴鼻免疫途径还可诱导粘膜免疫应答.
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VP7、VP4与轮状病毒装配及分子流行病学
A组轮状病毒是全球婴幼儿腹泻的主要病原,其外壳蛋白VP7和VP4在病毒黏附、穿人细胞、血凝及诱导产生中和抗体中具有重要的作用,它们还分别决定血清型G型和P型,VP4又以基因序列不同而分型,称为P[]基因型,而且由其决定的分子病学流行特点不断发生变化.文中对A组轮状病毒VP7和VP4以上几方面的研究加以综述.
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婴幼儿轮状病毒G血清型与腹泻病情关系的分析
A组轮状病毒(group A rotavirus, RV)是世界范围内婴幼儿腹泻的主要病原.根据RV的VP7和VP4蛋白分为G血清型和P血清型,而常见的为G1~G4,P[8]、P[4]和P[9]血清型[1].RV感染临床表现轻重不一,导致预后差异巨大,因此探讨RV腹泻临床严重程度的影响因素对于控制RV腹泻尤为重要.目前国内外一些有关RV血清型和基因型与不同临床表现关系的研究并未得到一致结论[2],故本研究拟通过对RV腹泻患儿临床病情严重程度的比较,了解本区域RV不同G/P血清型与腹泻严重程度和临床特征之间的关系,为临床防治轮状病毒肠炎提供进一步的理论依据.
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福州地区2009-2014年腹泻儿童轮状病毒特征
目的 了解轮状病毒在福州地区腹泻儿童中的流行情况.方法 收集2009-2014年5岁以下腹泻住院儿童粪便标本,用ELISA法检测轮状病毒抗原,RT-PCR法确定基因型别.对G9轮状病毒阳性标本的VP7基因全长测序及进化分析.结果 福州地区腹泻儿童轮状病毒高峰期在10～12月,呈单峰流行态势.G9轮状病毒在2011年后成为福州地区优势流行型别,毒株VP7基因核苷酸序列相似性92.5％～100％,毒株间有较高的同源性,进化分析都属于G9第3亚型.结论 G9轮状病毒在福州地区流行强度逐渐加强,目前已成为优势流行型别.毒株同源性高,属G9型3亚型.
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小鼠轮状病毒EW株VP7基因的克隆及其在重组腺病毒中的表达
目的:构建表达小鼠轮状病毒(EDIM)EW株VP7基因的重组腺病毒,以在小鼠模型上研究轮状病毒的免疫保护机制.方法:用RT-PCR方法扩增EDIM VP7全长cDNA并进行基因序列分析,将所得的VP7基因片段插入腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,获得重组质粒pShuttleCMV-EVP7,将该质粒与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183获得重组腺病毒质粒pAdCMV-EVP7,将该质粒线性化后转染293细胞包装重组腺病毒rvAdEVP7.以rvAdEVP7胛感染293细胞,并分别应用电子显微镜、PCR、RT-PCR和Western blot等方法观察rvAdEVP7的形态、VP7基因整合、遗传稳定性、VP7基因在细胞内转录及表达等有关生物学特性.结果:获得了小鼠轮状病毒的全长cDNA,重组腺病毒rvAdEVP7具有典型的腺病毒形态,PCR、RT-PCR和Western blot等分子生物学方法分析显示:rvAdEVP7中确有特异性的VP7基因稳定整合;有较好的遗传稳定性;感染293细胞后能有效转录;可表达轮状病毒主要结构蛋白VP7.结论:成功构建含VP7基因的重组腺病毒rvAdEVP7,为进一步研究轮状病毒的免疫保护机制打下了基础.
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蓝舌病病毒vp7基因的表达及其产物在c-ELISA中的应用
获得稳定、高效的具有良好抗原性的蓝舌病毒(Bluetongue virus,BTV)vp7基因重组抗原.将BTV编码群特异性抗原VP7的S7基因片段克隆至pMD18-T质粒载体中,构建S7克隆重组质粒,进行核苷酸序列分析.与已报道的多株BTV编码VP7的基因比较后发现,所测定毒株的核苷酸序列与BTV10型的S7基因同源性高达98.7%,推测的氨基酸同源性为99.3%,证实为BTV的S7基因.然后亚克隆插入pBAD/ThioTOPO表达载体,转化LGM194细胞,经抗性培养、PCR、限制性内切酶分析、测序鉴定,筛选获得BTV S7基因片段正向插入、有正确读码框的阳性克隆,成功构建了BTV群特异性抗原VP7的重组表达载体.经L-araboinose诱导表达,可稳定、高效地表达VP7蛋白抗原.SDS-PAGE、ELISA试验表明,表达蛋白为融合蛋白,具有反应原性,分子量约54.5kD,重组蛋白的获得率为1.52mg/g湿菌,其表达产量约占菌体总蛋白的12%左右,相当于93.5mg/L菌液.融合蛋白中含有BTV VP7特异性蛋白抗原,可作为c-ELISA包被抗原,为蓝舌病的免疫血清学诊断试剂的制备和分子生物学研究打下了坚实基础.
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一株野生型婴幼儿轮状病毒的分离鉴定与毒力测定
目的 从妇幼保健院腹泻患儿临床样本中分离鉴定一野生型人A组轮状病毒株,并对其毒力进行测试.方法 采集水样粪便样品,应用A组轮状病毒特异性抗体采用点杂交(Dot blot)方法检测,感染vero细胞并用TRIzol法提取病毒RNA,SDS-PAGE电泳分析病毒RNA迁移型式,以轮状病毒VP7通用引物扩增特异性鉴定,体内毒力分析.结果 Dot blot显示粪便中轮状病毒阳性,用通用引物PCR能扩增出轮状病毒特异条带,RNA电泳迁移型式为4:2:3:2.感染病毒株的vero细胞病变显著,实验鼠水样性腹泻严重,生长缓慢.结论 分离获得的病毒株属野生型人A组轮状病毒,具有较强的感染性和致病性.
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婴幼儿轮状病毒VP7基因cDNA文库构建
[目的]分离与培养婴幼儿轮状病毒,并克隆婴幼儿轮状病毒外壳蛋白VP7基因,导入pMD18-T载体,成功构建VP7基因cDNA文库,为构建轮状病毒基因工程疫苗奠定基础. [方法]提取婴幼儿轮状病毒总RNA,通过RT-PCR扩增,获得目的基因片段VP7,进行分离纯化与回收,后纯化的VP7基因与pMD18-T载体进行连接,进行质粒抽提与鉴定. [结果]提取的婴幼儿轮状病毒总RNA比较完整,28S、18S,5S条带清晰可见,成功扩增VP7基固,连接pMD18-T载体,转化感受态菌(DH5α),通过蓝白斑筛选得到DNA阳性重组子(载体+VP7基因片段).[结论]通过对婴幼儿轮状病毒培养、VP7基因扩增、基因片段回收、连接、转化、鉴定等一系列技术,初步确定婴幼儿轮状病毒外过壳蛋白VP7基因已导入pMD18-T载体,成功构建VP7基因cDNA文库,为进一步研制轮状病毒基因工程疫苗奠定了基础.
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轮状病毒结构蛋白VP7 HLA-A2.1限制性CTL表位的初步鉴定
目的预测并初步鉴定轮状病毒Wa株结构蛋白VP7 HLA-A2.1限制性CTL表位.方法用BIMAS软件预测VP7HLA-A2.1限制性CTL表位;分子模拟技术对分值高的4条肽进行分子模建;后测定候选肽与HLA-A2.1分子的亲和力及结合稳定性.结果结合BIMAS及分子模拟的预测结果,选择4条肽QLYCDYNLV(132-140)、LLNYILKSV(18-26)、VLMKYDQSL(140-148)及VNWKKWWQV(287-295)作为候选表位肽;4条肽与HLA-A2.1结合的荧光系数(FI)值分别为2.58、3.83、3.19及0.82,肽-HLA-A2.1复合物半数解离时间(DC50)分别为2～4、6～8、8及2 h.结论QLYCDYNLV(132-140)、LLNYILKSV(18-26)及VLMKYDQSL(140-148)为潜在的HLA-A2.1限制性CTL表位.
